甲型H1N1流感病毒致宿主细胞氧化损伤机制的研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

广州医学院硕士学位论文甲型 广州医学院硕士学位论文 甲型 H1N1 流感病毒致宿主细胞氧化损伤机制的研究 PAGE PAGE 10 甲型 H1N1 流感病毒致宿主细胞氧化损伤机制的研究 硕士研究生：马红梅 导 师：肖洪广 教授 中文摘要 流感病毒感染是严重威胁人类健康的最常见的原因之一。1930 年 R.E.Shope 成 功的用病猪呼吸道过滤液感染雪貂，分离出了猪流感病毒[1]。1933 年 Smith 等人将 首次从人体中分离到的病毒称甲型流感病毒 [2]。历史上第一次甲型流感大流行在 1918 年-1919 年造成 2000-4000 万人死亡[3-4]，本世纪初 2009 年的这次 H1N1 型流感 病毒侵袭人类并造成世界范围内的广泛流行。流感病毒致病机制的研究一直都是医 学研究的热点。2010 年，刘彦明等[5]用免疫组织化学染色法检测病毒感染狗肾转化 细胞（MDCK）之后细胞 DNA 鸟嘌呤的氧化损伤产物 8-氧鸟嘌呤脱氧核苷（8-oxo-7， 8-dihydroguanine，8-oxo-dG）的表达，实验结果证实甲型 H1N1 (Influenza A)流感病 毒感染能造成宿主细胞 DNA 氧化损伤，氧化应激的后果不仅是造成蛋白质、脂质的 氧化，还会造成核酸的氧化。另一研究表明 H1N1 型流感病毒能明显诱导宿主 MDCK 细胞凋亡，凋亡率随着检测时间推移升高[41]。在各种碱基中，鸟嘌呤最易被氧化成 8 －氧鸟嘌呤脱氧鸟苷（8-oxo-dG）[6]。DNA 上的 8-oxo-dG 既可以由于原位氧化，也 可由复制过程 8-oxo-dGTP 的错误掺入而致。人类细胞内 DNA 的低氧化状态维持依 赖多种基因修复酶，其中 8_羟基鸟嘌呤核苷酸酶（MutT homologue 1，MTH1）可以 水解核苷酸代谢池中的 8-oxo-dGTP 为 8-oxo-dGMP，阻断错误掺入过程[7]；而 8-羟 基鸟嘌呤 DNA 糖苷酶（8-oxo-guanine DNA glycosylase1，OGG1）能够清除 DNA 上 无论是由于原位氧化还是错误掺入而形成的 8-oxo-dG[8]。两种酶在不同阶段的共同 作用预防 DNA 的氧化或减轻 DNA 的氧化损伤，从而使 DNA 的正常低氧化状态得 以维持。2008 年 2 月份 DNA Repair 杂志刊登 Hill 的文章，作者发现氧化应激所致的 培养细胞 DNA 过度氧化与 OGG1 的降解有相关性[9]。同时，我们的前期研究结果表 明流感病毒感染靶细胞后，会导致靶细胞内氧化损伤标志物 8-oxo-dG 表达量增加， 提示了细胞发生氧化应激损伤，最终引起靶细胞凋亡，根据上述研究进展，我们认 为氧化损伤修复酶参与 DNA 过度氧化修复过程，可能在流感病毒致宿主细胞凋亡发 生发展的过程中起到一定的作用。目前国际上对流感病毒感染后宿主细胞 DNA 氧化 损伤机制的研究鲜有报道，本研究将从 DNA 氧化损伤修复方面探讨流感病毒致病机 制。 目的 本课题在流感病毒感染宿主细胞可导致脂质氧化损伤和 DNA 碱基氧化损伤的 基础上，进一步探讨其可能的作用机制。揭示流感病毒致宿主细胞的氧化损伤在宿 主细胞凋亡中的作用，即 DNA 的过度氧化损伤而氧化修复酶的表达不足以对抗过高 的氧化损伤，最终导致宿主细胞的凋亡和症状的发生发展。本研究旨在加强对流感 病毒致宿主细胞氧化应激机制的认识，为该病毒致病机理研究提供了新的思路，为 抗流感药物的开发提供新的靶点，也为高致病性人禽流感的预防、防控提供了新的 视角和依据。 方法 第一部分 流感病毒感染细胞模型的建立 采用细胞培养技术培养 MDCK 细胞。鸡胚尿囊腔接种 H1N1 型流感病毒，经病 毒复制、扩增、收获病毒，通过检测 MDCK 细胞的半数组织细胞感染剂量（TCID50）， 确定该毒株实验用毒剂量。 第二部分 流感病毒 H1N1 感染细胞后 MTH1 基因表达的研究 细胞培养后提取总 RNA，经优化 RT-PCR 反应检测细胞内 MTH1 基因的表达量。条 带经 Scion Immage 软件分析并与内参基因 GAPDH 相比，对体系的准确性、重复性和 灵敏度进行分析。MDCK 细胞培养后，H1N1 型流感病毒感染 0 h、1 h、3 h、6 h、 12 h、24 h、48 h，在各时间点进行检测：经 RT-PCR 反应检测细胞内 MTH1 基因的 相对表达量。 第三部分 流感病毒 H1N1 感染细胞后 OGG1 基因的表达的研究 MDCK 培养后提取 RNA，反转录成 cDNA，设计引物进行聚合酶链式反应对目 的基因 OGG1 进行扩增同时条带经 Image J 软件分析并与扩增的内参基因 GAPDH 相