艰难梭菌A毒素ELISA试剂盒的研制及微生态制剂对艰难梭菌感染的防治研究-内科学(消化专业)专业论文.docxVIP

中英文缩写词对照表 中英文缩写词对照表 艰难梭菌A毒素EL 艰难梭菌A毒素EL 1 sA试剂盒的研制及微生态制剂 对艰难梭菌感染的防治研究 中文摘要 艰难梭菌(c diffici幼是人与动物伪膜性肠炎(PMC)和抗生素相关性 腹泻的主要病原菌，该菌可产生至少2种毒素，A毒素为肠毒素，可导 致肠道组织损伤、使家兔产生血性积液并具有纤维细胞毒性，B毒素对 许多组织细胞都具有很强的毒性。目前，对艰难梭菌在腹泻和结肠炎中 的致病作用已有许多研究成果，而且也建立了一系列相应的治疗方法， 然而，由于艰难梭菌感染的治疗较为棘手，每年仍然有数百万病人被感 染，从而对艰难梭菌感染的诊断和治疗不断提出新的问题和挑战。因此， 本课题在艰难梭菌A毒素纯化、单克隆抗体制备、ELISA诊断试剂的研 制以及微生态制剂对艰难梭菌感染的防治方面进行了研究和探索。 首先，我们建立了一种改进的纯化艰难梭菌A毒素的方法。艰难梭 菌VPll0463菌株经透析培养，50％饱和硫酸铵盐析，酸沉淀，再经 DEAE-Toyopearl 650M离子交换层析。经生物学和免疫学特性分析，精 制的艰难梭菌A毒素蛋白含量为0．881 mg／ml，Native及免疫双扩 散均为单一带，分子量为550 kD，小鼠毒力为l×106 MLD／ml，Veto细 胞毒性为10 7CU／ml，凝血活性为l：512，家兔肠袢试验为重量长度(∥cm) 比为2．46。该纯化方法操作简便、实用、适合大规模制备A毒素。 其次，成功制备了抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体。用纯化的艰难 梭菌A毒素免疫BALB／C小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0 融合，采用间接ELISA和有限稀释法筛选和克隆化杂交瘤细胞，得到6 株(2H7，3E9，485，5C10，6G8和8A1)fl＆分泌针对艰难梭菌A毒素抗体 的杂交瘤细胞株。特性分析表明，5C10株细胞分泌的mAb为IgG2a，485 和8A1株细胞分泌的mAb为IgGl，其他3株细胞mAb(2H7、3E9和6G8) 均分泌IgM。腹水mAb的效价均在1：104以上。中和试验表明所有的mAb 一2一 均无中和活性。其中mAb2H7、6G8、5C10、4135和8A1具有共同的表 均无中和活性。其中mAb2H7、6G8、5C10、4135和8A1具有共同的表 位，而mAb 3E9识别的位点与其它5株不同。mAb8A1和485的相对 亲和力105，其它4株mAb的相对亲和力104。在非变性条件下，PAGE 后Westernblot的结果显示，6株mAb均可与Mr为550 kD的A毒素产 生反应；而在变性条件下，还原与非还原SDS后Western blot均 显示，6株mAb均可与Mr为50kD一240kD的A毒素产生反应。 第三，利用该单克隆抗体，我们建立了一种具有良好特异性和灵敏 度的检测艰难梭菌A毒素的央心ELISA试剂盒。该试剂盒采用纯化的抗 艰难梭菌A毒素的兔单特异血清作为捕捉抗体包板，10％BSA．PBST封 闭，加入检测样品，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体 (HRP．485 mAb)作为检测抗体，用底物TMB显色，最后用2 mol／L H2S04 终止反应，测定A450。经过对2株艰难梭菌产毒株、2株艰难梭菌非产 毒株、26株大肠杆菌、4株痢疾杆菌、1株双歧杆菌、5株霍乱弧菌、2 株伤寒沙门菌、7株肉毒梭菌、l株索氏梭菌、1株酪酸梭菌的培养滤液 和58份粪便样品进行检测，除2株艰难梭菌产毒株的培养滤液和4份粪 便样品为阳性外，其余49份培养滤液及54份粪便样品均为阴性，最低 可检出艰难梭菌A毒素1 ng／ml。初步表明这种艰难梭菌A毒素的单克 隆抗体酶标诊断试剂盒具有较高的特异度和灵敏度。可望适合临床应用。 医院内感染已经成为控制艰难梭菌感染的一个难题。根据近年来对 艰难梭菌医院内感染的调查，这种感染的发生率逐年增加，说明现有的 控制艰难梭菌感染的方法效果欠佳，有必要探索更好的预防和治疗方法。 最后，本课题对艰难梭菌感染后小鼠的肠粘膜损伤状况及非产毒株 和酪酸梭菌对艰难梭菌感染的防治效果进行了观察。先用艰难梭菌产毒 株人工感染BALB／C小鼠，感染前后分别用艰难梭菌非产毒株及酪酸梭 菌迸行预防与治疗，并检测盲肠内容物细胞毒性和对肠粘膜病理观察。 结果证实：艰难梭菌非产毒株及酪酸梭菌不能预防BALB／C小鼠艰难梭 菌的感染，但在艰难梭菌感染后使用则能明显降低艰难梭菌的产毒力和 盲肠粘膜的病理损伤。说明艰难梭菌非产毒株及酪酸梭菌对小鼠艰难梭 菌感染有明显的治疗作用，而且这种作用与艰难梭菌产毒降低有关。 关键词艰难梭菌：A毒素；纯化；单克隆抗体；ELISA酪酸梭菌； 感染；防治 ——’～ Development Develo