尖孢镰刀菌的DNA转化及其转化子表型的初步分析-植物病理专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文摘 浙江大学硕士学位论文 摘 要 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的重要植物病原真菌， 寄主范围广泛，可引起100多种植物的维管束萎蔫病害，了解它的致病分子机理 对植物维管束萎蔫病害的有效防治具有重要意义。显然，通过致病相关基因的鉴 定是达到这一目标的关键所在。许多致病相关基因是通过DNA插入突变产生致 病缺陷突变而分离得到的。限制酶介导整合转化(restriction enzyme．mediated integration，REMI)正被越来越多地应用于丝状真菌致病相关基因的标记与克隆。 另外，近年来农杆菌介导的DNA转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，删T)也开始应用于一些丝状真菌的转化。 本研究较系统地对尖孢镰刀菌的REMI转化体系进行了优化，并对部分转化 子的表型进行了初步的分析。研究结果表明尖孢镰刀菌菌体的培养时间、胞壁降 解酶的种类、酶解时间和温度、再生培养基等一系列因素对原生质体释放及再生 有明显的影响。根据研究结果总结出一套有效的尖孢镰刀菌原生质体制备的方 法：从PDA固体培养基上培养8天的菌落上洗下尖孢镰刀菌孢子，将孢子按浓 度7．4×10。7～1．0×108个／100ml接种到PDB液体培养基中，2712下振荡培养11～ 13个小时，过滤洗涤收集菌丝，然后用12mg／ml溶壁酶和4mg／ml蜗牛酶组成的 混合酶在33(2、80rvm的条件下酶解4～5个小时，过滤、洗涤、收集原生质体。 一般300ml菌丝培养液可以得到3ml左右、浓度为5．0×10 7～1．44×108个／ml的 原生质体。通过对比实验表明，不同的质粒和限制性内切酶的种类对尖孢镰刀菌 的REMI转化效率也有较明显的影响。在相同实验条件下，pCBl004质粒的 REMI转化效率比pCBl003的高；用内切酶BamH I介导的转化效率也比Hind Ill 的高。实验结果还表明，REMI的转化效率是一般质粒转化效率的19．12～22．72 倍。 本文利用限制酶介导DNA插入突变(REMI)转化尖孢镰刀菌黄瓜专化型 代表菌株ATCCl6416，共获得了123个尖孢镰刀菌转化子。对以上所得的123 个转化子进行生长速度及产孢量的初步测定，发现产孢量比ATCCl6416降低了 1～4．5倍的有13个转化子，产孢量升高了1．35～3．59倍的有12个转化子。对所 浙江大学硕士学位论文有转化子在PDA上生长速度的测定结果显示，其中10个转化子的生长速度比 浙江大学硕士学位论文 有转化子在PDA上生长速度的测定结果显示，其中10个转化子的生长速度比 ATCCl6416有不同程度的减慢。对以上生长速度变慢的10个转化子做了初步的 致病性分析，发现H60和52两个转化子的致病性变弱。 本文还构建了1个适用于丝状真菌农杆菌介导转化(An盯)和基因突变的 双元载体ATMTl。该质粒是在pCAMBIAl300质粒的基础上构建的，其关键之 处是用缸pC启动子代替了35S(CaMV35S)启动子，使之适合丝状真菌的转化。 关键词；尖孢镰刀菌；原生质体制各；REMI转化；转化子表型分析；ATMT转化载体； II 浙江大学硕士学位论文Abstraet 浙江大学硕士学位论文 Abstraet Fusarium oxysporum causes plant vacicular wilt diseases worldwide and is one of the most economically important phytopathogens．A beaer understanding of the molecular basis involved in the pathogenesis of the fungus would be invaluable in obtaining targets for fungicide fungicide development and therefore control of the disease．Obviously，the identification of genes required for pathogenicity is a key step in achieving this goal．REMI(restriction enzyme-mediated integration)，a widely applied gene tagging technique，is all efficient way to identify genes required for pathogenicity in some