钾离子通道参与海马神经干细胞体外分化发育机制的研究-神经生物学专业论文.docxVIP

博士学位论文钾离子通道参与海马神经干细胞体外 博士学位论文 钾离子通道参与海马神经干细胞体外 分化发育机制的研究 博士研究生： 郭洪波 指导教师： 邹飞教授 摘要 神经干细胞(NSCs，neural stem cells)以其可自我更新和增殖、分化产 生中枢神经系统主要类型细胞的多分化潜能，在临床细胞替代疗法与细胞移植 中具有重要意义。同时，NSCs也为神经发育学和表观遗传学的研究建立了良好 的模型。对NSCs及其分化子代细胞功能特性的研究，尤其是对在神经系统电信 号传导中起重要作用的膜离子通道(ion channel)的研究已渐成为热点。然而 在神经发育过程中，关于在神经兴奋性和突触整合的调控机制中发挥关键作用 的电压门控性钾通道(Voltage—gated potassium channels，Kv)的改变尚缺 乏报道。正是基于此，本实验应用膜片钳技术，对新生sD乳鼠海马组织源 cNSCs(Cultured neural stem cells)中Kv的基本电生理特性及其在体外诱导 分化神经元不同发育阶段的改变进行了较深入的研究，以期为NSCs的临床应用 和神经发育机制的进一步研究提供重要的理论依据。 目的 研究新生sD乳鼠海马cNSCs的中Kv通道的基本电生理特性及EPO对其的调 控并探讨机制，和海马cNSCs体外诱导分化神经元在不同发育阶段Kv通道特性 的改变，以期为NSCs的临床应用，NSCs增殖及诱导分化调控机制和神经发育机 制的阐明提供重要的理论依据。 中文摘要方法 中文摘要 方法 利用无血清培养、单细胞克隆技术，添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和脑源性神经营养因子(BDNF)等生长因子，体外培养sD乳鼠海马组织源NSCs； 添加维甲酸(all—trans一队)、胎牛血清(FBS)等诱导NSCs的分化；以免疫细 胞化学方法对eNSCs及其分化后子代细胞进行鉴定；采用膜片钳技术的全细胞 模式、细胞贴附式和内面向外式记录cNSCs及其分化神经元在不同发育阶段的 膜被动特性和Kv通道主动特性。 结果 (I)sD乳鼠海马组织在体外无血清培养条件下6～8d可形成悬浮生长的、 具有连续克隆能力的、表达Nestin的神经球，悬浮细胞团状结构由几个至数百 个细胞组成不等；上述Nestin+细胞在RA和FCS等诱导条件下可分化产生具有网 状联系的、分别表达Tujl和GFAP的细胞。 (2)在增殖期，不同接种密度条件下培养基中加入EPO后，Nestin+细胞数 较对照组增加约2～4倍；在分化期，加入EPO后Nestin+细胞数明显减少，同时 较早出现表达Tujl和GFAP细胞；Tujl’细胞(57％)较对照组(47％)明显增加， 加,Kanti—EPO组Tujl+细胞较对照组(28％)明显减少；相同细胞接种密度下， 四种不同剂量EPO添加组，Tujl+细胞数呈剂量依赖性增加。 (3)采用膜片钳全细胞记录模式发现未分化状态下的海马cNSCs至少含有 三种外向Kv通道：第一种表现为激活速度缓慢，约20～30ms后达到稳态，在 所测定范围内无自行失活，浴槽液中加入5mM阻断剂TEA使+40mY时的电流幅度 降低56．8±5．9％(n=17)，分析为延迟整流钾电流(Im，Delayed rectifier outward K+currents)；第二种电流呈现快速激活和失活的特性，可被5mM阻 断剂4一AP阻断，推断为瞬时外向钾电流(I一，Transient A type K+currents)。 其中，87．5％的未分化状态下海马cNSCs(n=48)仅表达Im而缺失I一，余12．5 ％cNSCs同时表达Im和I。；第三种电流可被Iberiotoxin(IbTX，一种Bk通道 II 博士学位论文 博士学位论文 的特异阻断剂)抑制，采用膜片钳内面向外记录模式记录通道活动发现，通道的 开放概率(P。)随去极化程度和胞内钙离子浓度([Ca2+]，)的增加而明显增大， 即对电压和[ca”]。均具有明显依赖性。当浴槽液及电极液中钾离子浓度对称 ([K+]；／[K+]。=140／140)时，通道电导为184±17．6pS(n=8)，翻转电位接近Omy。 分析为大电导钙激活钾通道(Bl(c。，Large—con血ctance Ca“一activated potassium channelS)。 (4)采用膜片钳全细胞记录模式，浴槽液中添加EPO可明显增加乳鼠海马 cNSCs B陆的全细胞电流密度。细胞贴附式记录模式下，浴槽液中10 U／L EPO 增强BI(c。通道的活性，表现为增高通道的开放概率：而电极液中的10 U／L EPO 则可使BI(ca通道的开放概率显著增高，且这种作用过程较前者发生迅速，并持续 整个记录过程(接近30min)；