甲状腺素抗体IgY制备和放免中的应用-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

天津医科大学硕士学位论文摘 天津医科大学硕士学位论文 摘 要 f选择鸡作为免疫对象是因为其具有抗原所需剂量小，无需抽血就可以 ～～、f 获得大量从血清转运至蛋黄中的抗体。此蛋黄中的抗体称为IgY(Yolk lmmunoglobulin)。 首先将T4甲酯化再与牛血清自蛋白(BSA)偶联为全抗原，分别对 A、B两只鸡进行免疫。A鸡首次免疫20u g。20天后实施加强免疫50u g。首次免疫后第62天实施第三次免疫100 u g。首次免疫后第36天在血清 中检测到抗体，蛋黄中则晚8天检测到抗体。B鸡首次免疫100 u g，45天 后实施第二次免疫。首次免疫后第35天在血清中检测到抗体，蛋黄中则晚 6天检测到。在首次免疫后的两个月内两只鸡血清中抗体含量始终高于蛋 黄，随着以后加强免疫，蛋黄中抗体含量增加并逐渐追上血清中抗体含量 后超出，但两者间差距始终不很明显。总体看来A鸡抗体含量增高的趋势 优于B鸡。本文观察到首次免疫与后来加强免疫剂量(A鸡全程免疫共用 870H g抗原，B鸡共用950v g)对抗体产生起到重要的作用。高效价抗体 在鸡最后一次免疫两个月后才有下降的趋势。 蛋黄经去离子水1：2稀释后加等倍正丁醇去脂为宜：蛋黄l：2水稀 释后，pH在5．0-10．0时蛋黄去脂上清IgY没有丢失；正丁醇去脂不同操作 流程(4C静置30min、室温静置30min、摇动后立即4℃3000xg离心 15min)对IgY的含量和结合抗原的活性没有影响；正丁醇对IgY的活性无 影响。另外正丁醇比水稀释法去除杂蛋白效果好。蛋黄正丁醇去脂后应用 饱和硫酸铵和饱和硫酸钠两种不同盐析法纯化IgY进行比较，饱和硫酸铵 略好于饱和硫酸钠盐析法，其纯化后所获得的产量达9．5mg IgY／ml卵黄， 天津医科丈学硕士学位论文纯度94．1％。经SDS—PAGE分析，盐析法纯化IgY蛋日带清晰。总之正丁 天津医科丈学硕士学位论文 纯度94．1％。经SDS—PAGE分析，盐析法纯化IgY蛋日带清晰。总之正丁 醇去脂是一种快速、简便、有效的纯化IgY的方法× ／ 本文应用蛋黄正丁醇去脂获得的抗14一IgY建立了放免检测方法，对抗一 T4IgY的质量进行鉴定：抗体滴度为1：2500，工作浓度在1：2500至 1：5000范围内；与T3的交叉反应为1．28％；亲和常数为2．13×109L／mol。 这些合乎放免测定所需要的要求。方法学考核数据如下：最小检出量为 I．67ng／ml；批内平均变异系数为513％，批间平均变异系数为7．0％；平均回 收率为96．13％。用本法与l|缶床实验室应用的IgG—RIA法同时测定20例标 本后进行配对t检验，两种方法测定结果差别无显著性，呈显著正相关 (严0．9988)。本文制备的IgY用于放免测定临床标本能很好地区分甲亢、 甲低和正常人群。 关键词：IgY 抗体产生规律正丁醇抗．TdgY放射免疫测定法 天津医科大学硕士学位论文Abstract 天津医科大学硕士学位论文 Abstract It is considered that laying hen，as the immune object，has some advantages such as need of fewer of antigens to immunize，no need of abstraction acquiring amount of antibodies which are efficiently transferred from blood to the yolk，and SO on．Antibodies in the yolk are collectively named yolk immunoglobulin(IgY)． T4 esterized with methanol and conjugated witll bovine serum albumin WaS used as antigen．We adopted two different ways for immunizing two hens and observed production paRem of antibody．Hen A Was primarily immunized wi也20 la g antigen．After 20 days，boosted with 50 u g．The tllird immunization Was carded out with 100 l-t g at 62 days after primary immunization．Specific antibody in serum appeared at day 36 following the