酵母双杂交系统的建立及CLN8P互作蛋白的筛选与初步鉴定-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

Y’787786原创性声明 Y’787786 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了职确的说明。 作者签名：电炒 蹴2005年4爿28日 关于学位论文使用授权说明 本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文，允许学位论文被查阕和借阅；学校可以公布学位论 文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文； 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名蔼查f之导师签名：侈麝稚日期：2005年5月16 日 摘 摘 要 目的：神经元蜡样脂褐质沉积症(聪u砌1al ccrold lipofuscinoses，NCLs)是一 组人类进行性神经元变性疾病．多为常染色体隐性遗传。基本特征为溶酶体内 蜡样脂褐质沉积。主要分为NCLl～NCLl0 10型，CLN8为NCL8的致病基因， 其功能及其在发病机制中的作用尚不清楚。本研究首先建立酵母双杂交系统， 再应用该系统从人胎脑文库中筛选CLN8P相互作用蛋白质，并对候选蛋白进 行初步鉴定分析。通过对相互作用蛋白质的筛选及研究，探讨CLN8的功能， 为NCL8和NCLs疾病群的发病机制研究提供线索，并为疾病的蛋白质相互作 用网络提供资料。 方法：1)以SV40大T抗原和P53蛋白的相互作用为阳性对照建立酵母 双杂交系统；2)将CLN8编码区序列克隆至MATCHMAKER LexA酵母双杂 交系统pLexA质粒，构建诱饵(bait)—pLexA．CLN8，再将pLexA．CLN8质 粒转染酵母菌株EGY48(p80p—LacZ)，建立EGY48(p80p—LaeZ)·pLexA-CLN8 融合菌株，检测其毒性和自激活性；3)以pLexA-CLN8为诱饵质粒，应用序 列转化法筛选人胎脑cDNA文库，得到Leu+LaeZ+阳性克隆，并用酶切鉴定其 外源性片断：4)应用共转化法将获得的阳性质粒与诱饵质粒一对一重新转入 酵母菌内，对相互作用进行验证；5)对验证后的阳性克隆的外源性片断进行 测序及同源性分析。 结果：1)建立了酵母双杂交检测系统；2)构建了酵母表达质粒pLexA． CLN8及EGY48(pSop-LaeZ)-pLexA．CLN8融合菌株，并通过检测证实CLN8P 对酵母细胞无毒性、无自激活性；3)以构建好的EGY48(p80p-LaeZ) ．pLexA-CLN8融合菌作“诱饵”，从人胎脑eDNA文库中筛选得到60个 Leu+LacZ+阳性克隆。提取质粒扩增后酶切鉴定，获得有外源性片断的质粒45 个；4)将获得的具有外源性片段的文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母 体内，对相互作用进行验证，共获得阳性克隆22个：5)对验证后阳性克隆测 序并进行同源性分析，共获得不同的候选基因序列lO个。 结论：1)在本实验室建立了酵母双杂交系统，并且在建立酵母双杂交系统 过程中，分析了影响酵母转化效率的因素，以及怎样尽量减少假阳性率的发生， 为本实验宣酵母双杂交技术平台的建立提供了经验：2)构建了pLexA-CLN8 诱饵质粒及EGY48(pgop-LacZ)-pLexA．CLN8融合菌株；3)应用酵母双杂交 诱饵质粒及EGY48(pgop-LacZ)-pLexA．CLN8融合菌株；3)应用酵母双杂交 系统，共筛选得到10个不同的基因，其编码蛋白与CLNSP有相互作用。 关键词：酵母双杂交系统，CLN8，神经元蜡样脂褐质沉积症，互作蛋自 Construction Construction of Yeast Two-Hybrid System and Screening and Identiffeaton of Interactive Proteins of CLN8P Abstracts objective：The neuronal ceroid lipofuscinoses aCb)，a group of progressive neurodegenerative disorders in human,are characterized by intralysosomal accumulations of ccroid lipopigraent material in the form of granular,curvilinear, fingerprint，rectilinear and mixed profiles．The NCLs comprise at least ten re