酵母模式生物用于依赖DNA序列的核小体定位实验初步研究遗传学专业论文.docxVIP

内 内蒙古科技大学硕士学位论文 I I 摘 要 核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位，它不仅起基本的结构作用，更 重要的是通过其在基因组上的定位及其组蛋白复合物的化学修饰调控诸如 DNA 复 制、转录和修复等基因表达过程。核小体定位是在表观遗传学水平上调控基因表达 的重要层次。研究表明，核小体定位主要受两种因素影响，一是 DNA 序列，二是一 些反式作用因子。 真核生物复制起始的调控是复制调控的一个重要环节，酵母复制依赖的顺式作 用元件称为自主复制序列(ARS)，该序列趋向于核小体缺乏区，但其活性并不完全由 核小体位置决定，还可能与两侧的序列特征和核小体分布有关系。本文利用体外组 装核小体技术、DNA 标记技术等，以酵母 ARS 为研究对象，探讨序列特征对核小体 定位及自主复制序列活性的影响。具体研究内容如下： 1. 测定了酿酒酵母 YPH499 的生长曲线，在 YPD 液体培养基中 30℃、200r/min 振荡培养 12-22h 的时间段内酵母处于对数生长期，其倍增时间为 2.008h。 2. 分别采用了溶菌酶处理法、蜗牛酶过夜处理法、蜗牛酶反复冻融处理法、珠磨 法提取酵母基因组，结果表明：溶菌酶法不能够提取酵母基因组，其他三种方法均 能提取出酵母基因组 DNA，相比较珠磨法提取的酵母基因组质量高、成本低、时间 短且操作简单，是提取酵母基因组 DNA 的最佳方法。 3. 利用 BrdU 标记整合了带有 HSV–TK 和 hENT1 基因的酿酒酵母 DNA，液体振 荡培养 14h 加入 BrdU，分别标记 1、3、5h，用 DAPI 对整个基因组 DNA 染色，再 利用带有 FITC 荧光标记的抗体检测 BrdU，发现标记 3h 时荧光强度最大，大约 55.3%的酵母基因组 DNA 中渗入了 BrdU。 4. 采用酸抽提的方法从未饥饿处理和经过不同时间饥饿处理的酵母细胞中提取组 蛋白，经 15% SDS电泳检测、Bradford 法测定蛋白浓度，结果显示：抽提物 中含有组蛋白 H1、H2A、H2B、H3 和 H4，从未饥饿处理的酵母细胞中提取的组蛋 白浓度高，但有部分杂蛋白存在；经不同时间饥饿处理的酵母细胞中提取的组蛋白 浓度较低，但是杂蛋白含量明显减少；且随着饥饿时间的延长，组蛋白和杂蛋白含 量都逐渐减少。 5. 采用 601 序列建立体外组装体系及检测方法，将纯化的酵母 ARS304、305 与纯 化的组蛋白八聚体在体外梯度盐透析组装形成核小体，利用 EB 及 Biotin 标记检测， 结果显示：不同组蛋白八聚体与 DNA 的比例形成核小体的数量不同，同一比例下 ARS304、305 形成核小体的能力不同，ARS305 较 ARS304 结合核小体能力强。 关键词：核小体定位；酵母；自主复制序列；BrdU 标记；体外组装 II II Abstract Nucleosomes are the basic repeating units of eukaryotic chromatin. They not only play a basic structural role, but also participate in the regulation of gene expression proeesses through positioning in the genome and their chemical modification of the histone complex, such as DNA replication, transcription and repair. Nucleosome positioning is the important level of epigenetic regulation of gene expression. Studies have shown that nucleosome positioning is mainly affected by two factors, one of which is DNA sequence, and the other is the trans-acting factor. One of the most important mechanisms to regulate DNA replication in eukaryoticcells is to regulate the initiation of the replication. Autonomously Replicating Sequence (ARS) of Saccharomyces cerevisiae is the cis-acting sequence r