酵母内质网嵌膜GTP酶Seylp的表达 纯化及结晶-生物学;微生物学专业论文.docxVIP

大学学位论文原创性声明 大学学位论文原创性声明 交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 瞳堂武 2011年6月1日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 酵母内质网成管蛋白Seylp的表达、纯化及晶体筛选 申请密级 口限制(受年) 口秘密(10年) 口机密(20年) 保密期限 20 年 月 日至20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 限制★2年(最长2年，可少于2年) 秘密★10年(最长5年，可少于5年) 机密★20年(最长10年，可少于10年) 中文摘要摘要 中文摘要 摘要 于真核细胞中的一类在形态、功能上保守的细胞器。在 网分为管状内质网、片层状内质网两大基本形态，并且 的生理功效。现已有研究发现，许多蛋白质参与到了管 一过程中。Seylp蛋白是酵母体内的一类dynamin家族 GTPase膜嵌GTPase蛋白，定位于内质网并在管状内质网处富集。有研究表明 Seylp与其哺乳动物同源蛋白Altastin对管状内质网的形态维持起到关键的作 用。为了研究Scylp蛋白如何维持管状内质网形态，以及其探究其介导膜的融 合／裂解方面的分子机制，本研究从结构生物学、生物化学的角度出发来研究 Scylp蛋白在对内质网塑形方面的精确工作机制。 本实验首先成功构建了Seylp的N端胞浆区全长的载体，然后通过二级结 构预测、胰酶不完全降解实验、质谱分析以及对Seylp结构域的分析，确定了 不同的克隆片段，并将蛋白在大肠杆菌中进行表达，利用不同的纯化方法最到 了高纯度的蛋白。接下来，通过分子筛层析分析、GTPase酶活分析等手段确定 了具有生物学活性且性质稳定的蛋白片段。在此基础上对相应蛋白进行了晶体 的筛选工作，最终得到了相应的蛋白晶体，但X衍射初步分析表明，晶体的衍 射效果不佳。 为了提高晶体的衍射质量，对蛋白进行了不同处理，对结晶条件进行了进 一步优化，并通过对晶体本身进行了不同方式的处理。通过综合运用以上手段， 极大的提高了晶体的衍射质量。通过目前所得到的研究结果，使我们对Seylp 蛋白发挥生理功效的方式有了进一步的了解，并为Seylp结构的最终解析以及 阐明Seylp在对管状内质网的塑形方面的分子机制奠定了坚实的基础。 关键词：内质网，蛋白纯化，蛋白晶体，X衍射分析，Seylp exclusively exclusively localise ER and enriches at ER tubules．Studies also suggested that Seylp and its function orthology Atlastin in mammals play vital roles in the maintenances of tubular ER network．In this study,we employ structural and biochemical assay to investigate the detailed molecular mechanism of Seyl p in maintaining ER morphology and mediating tubular ER fusion／fission． Firstly we successfully cloned the full eytosolic domain at N-termius of Seylp，and then found different protein fragments determined by secondary structure prediction, trysin-digestion,and mass spectrul／l assay,plus with protein struettae domain analysis．The prokaryotie expression system is suitable for the expression of different fragments of Seyl p protein．By using different chromatography systems，the purifications of all pr