细胞生物学的研究方法.pptVIP

Chapter 2 Methods and techniques of cell biology 教学内容 第一节 显微技术 第二节 生物化学与分子生物学技术 第三节 细胞分离技术 第四节 细胞培养与细胞杂交 研究技术、研究工具 显微镜的出现——细胞学说的建立 电子显微镜技术——进入超微与分子形态水平 超离心技术 细胞成分、代谢过程的 —— 同位素示踪技术 精确定性、定量分析 单克隆抗体、分子杂交——生物工程 第一节 显微技术microscopy  显微镜是观察细胞的主要工具。 根据光源不同，分为光学显微镜light microscope和电子显微镜electron microscope两大类。 Microscopic structure（显微结构） Submicroscopic structure （亚显微结构）(ultrastructure超微结构) —、光学显微镜light microscope 普通光学显微镜 构成 ①照明系统 ②光学系统 ③机械装置 分辨力（resolution） 是指显微镜或人的眼睛在25cm处能分辨物体最小间隔的能力。 分辨力的大小决定于光波的波长和镜口率以及介质的折射率。 荧光显微镜fluorescence microscope  落射式照明原理 荧光显微镜和普通显微镜的区别： 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope） 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。 激光共聚焦扫描显微境 蓝色为细胞核，绿色为微管 暗视野显微镜（dark field microscope ） 暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 暗视野照明方式 相差显微镜（phasecontrast microscope ）???? 相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。 二、电子显微镜electron microscope （一）透射电子显微镜 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。 1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，目前TEM的分辨力可达0.2nm。 电镜与光镜的成像原理基本一样，所不同的是用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有50nm的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ulra-microtome）制作。 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成 超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差。 负染技术 负染就是用重金属盐如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 冰冻蚀刻freeze-etching  标本置-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。 升温，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面的结构——蚀刻（etching）。 蚀刻后，向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。 然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。 复膜显示出了标本