结核分支杆菌分泌蛋白MPT64基因克隆表达-外科学专业论文.docxVIP

Ningxia Medical University Thesis for Application of Master’s Degree Cloning,expressing purifying secreted protein MPT64 of Mycobacterim tuberculosis. Student’s Name: Shi Hua Supervisor： Wang Zili Prof. Assistant supervisor: Subject Category: Medicine Major: Surg Specialty: Spine surg School: Ningxia Medical University Completion Date: Apr. 2011 宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明 引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名＿＿＿＿＿ 论文导师签名＿＿＿＿＿ 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有 关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁 夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公 布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名＿＿＿＿＿ 论文导师签名＿＿＿＿＿ 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 I I 结核分枝杆菌分泌蛋白 MPT64 基因克隆表达 摘 要 目的：构建结核分枝杆菌 MPT64 原核表达载体 pET32a-MPT64 并诱导其表达、纯化 及鉴定目的蛋白。 方法：采用 PCR 从 MTB H37Rv 株 DNA 基因组中扩增 MPT64 基因，将目的片段 克隆至 pET32a 载体中进行测序。鉴定阳性重组质粒 pET32a-MPT64，经测序证实与 Genebank 公布的基因序列基本一致。将 MPT64 基因亚克隆入 pET32a 原核表达载体， 酶切鉴定阳性重组质粒 pET32a-MPT64，并用 IPTG 进行诱导表达。SDS检测和 Western-blot 鉴定表明，在相对分子量为 24kDa 的位置有特异性目的蛋白表达。采用 MagExtractor-His-tag 蛋白纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化 结果：经测序证实，获得的目的基因与 GeneBank 公布的结核杆菌 MPT64 基因序列 基本一致。构建的原核表达载体 pET32a-MPT64 在大肠杆菌 BL21 中经 IPTG 诱导后表达 出相对分子量约为 24000 的蛋白，MagExtractor-His-tag 蛋白纯化试剂盒纯化后经抗组 氨酸单克隆抗体进行 Westren blotting，在相对分子量约 24000 处可见特异性着色带。 结论：成功构建了原核表达载体 pET32a-MPT64，并成功诱导了 MPT64 蛋白的表达， 通过 MagExtractor-His-tag 蛋白纯化试剂盒纯化获得纯度较高的 MPT64 蛋白，为 MPT64 蛋白作为免疫原在下一步研究中提供条件。 [关键词] 结核分枝杆菌，MPT64，基因表达，克隆，蛋白质类/分离与提纯 宁夏医科大学硕士研究生学位论文英文摘要 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 英文摘要 II II Cloning,expressing purifying secreted protein MPT64 of Mycobacterim tuberculosis. ABSTRACT Objective To clone the MPT64 gene of mycobacterium tuberculosis bovis ， and construct prokaryotic plasmid of mycobacterium tuberculosis MPT64 and express it in E.coli， further more，to obtain high pure MPT64. Methods The whole MPT64 DNA sequence was amplified from mycobacterium tuberculosis b