结合乳腺肿瘤患者血浆游离DNA和无创产前检测结果的模拟研究-外科学专业论文.docxVIP

硕士学位论文材料和方法 硕士学位论文 材料和方法 该研究纳入2015年5月至7月期间在中国广东省广州市南方医科大学南方 医院诊断出乳腺肿瘤的36例术前女性患者。南方医院伦理委员会的机构审查委 员会准予该研究。所有参与者均在参与本研究前均签署得到伦理委员会认可的 知情同意书。中国广东省广州市达瑞生物技术股份有限公司提供2l、18、13三 体流产组织样本。样本经比较基因组杂交确定核型。从组织样本中提取基因组 DNA继而应用Covaris S2超声波(Covaris，Woburn,M八USA)处理器打断。 用Agencourt XP磁珠纯化打断后的140-200 bp的片段DNA，最后用Qubit 3．0 (Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)定量并记录。该研究共纳入2015年5 月至9月期间经生物化学和超声筛选被诊断出胎儿非整倍体高危并且在广州达 瑞生物技术股份有限公司进行无创产前检测的孕妇1252例。同时征募了99例 未孕健康女性作为阴性对照人群。 本研究纳入2015年5月至7月期间在中国广东省广州市南方医科大学南方 医院诊断出乳腺肿瘤的36例术前患者。所有病例都经过活检术后病理确诊乳腺 良性或恶性肿瘤。用EDTA抽血管抽取5．10 ml外周静脉血样本，在24小时内 分离血浆，48小时内提取出DNA。抽取5 ml未孕健康女性外周血。所有血样 本均在24小时内通过1，600×g 4℃低温离心10分钟后将上l层血浆转入新的 离心管，再1 6，000×g离一t3 1 5分钟后去掉残余血细胞，将上层血浆转移到新的 离心管后，置于．20℃中备用。根据使用手册应用一常用的血浆游离DNA提取 试剂盒(GenMag Circulating DNA fiom Plasma Kit,GenMag Biotech,Beijing, China)从700 gl血浆中提取DNA，继而用Qubit 3．0定量后置于．20℃冷藏中备 用。 在未孕健康女性血浆游离DNA样本中分别加入10％的21、18、13三体胎 儿DNA建立阳性参照样本。将乳腺肿瘤女性的血浆游离DNA分成4份(每份 均从700 gl血浆中提取获得)，分别加入l 3％的21、18、13三体胎儿DNA建 立试验样本。 III 万方数据 中文摘要应用Ion 中文摘要 应用Ion Plus Fragment Library Kit将DNA样本和我们混合的DNA混合物 依据调整后的Ion Xpress基因组DNA片段文库构建(Life Techmlogy)使用指 南分别构建文库。简单来说，应用一系列酶和聚核苷酸连接酶将DNA片段两 断端进行末端修复，其中一端包括了一段有效连接barcode标记物的DNA链。 引物酶混合物用于10个循环的聚合酶链反应。各种不同溶度的AMPule XP磁 珠用于文库构建各个步骤的纯化(包括末端修复，接头连接和扩增)。继而，文 库样本利用Ion OneTouch 2系统通过乳化聚合酶链反应进行聚集和扩增，用以 自动形成Ion Sphere particles(ISP)模板产物。根据使用手册将阳性ISP模板 应用Ion OneTouch富集并立即置于Ion半导体芯片上用Ion Proton sequencer 300 个flows测序。 总而言之，在本研究中，我们用标准的无创产前检测方法检测36例患有乳 腺肿瘤的未孕患者的血浆。这些样本继而与2l、18、13三体胎儿DNA血浆样 本相混合以探索在患有良性或恶性乳腺肿瘤的孕妇中母体肿瘤对无创产前检测 结果的影响程度。 结果 本研究纳入了36例乳腺肿瘤患者、99例未孕女性和1252例健康孕妇。孕妇 血浆游离DNA的平均浓度是6．76 ng，乳腺肿瘤患者血浆游离DNA的平均浓度是 6．44 ng，未孕健康女性的血浆游离DNA的平均浓度是4．18 ng。和健康的未孕女 性相比，孕妇以及乳腺肿瘤患者的血浆游离DNA浓度较高，差异有显著性统计 学意义(尸0．05)。相反，孕妇血浆游离DNA浓度和乳腺肿瘤患者血浆游离DNA 相比，差异无统计学意义(尸=0．277)。针对36例乳腺肿瘤患者的无创产前检测 结果分析中，在其中两例患者的血浆游离DNA样本中检测出多个染色体异常， 尤其是8号染色体。在样本17和样本32中，8号染色体的z值明显高于其他变异的 染色体(占LL5．56％)。在这两例乳腺肿瘤患者的血浆游离DNA样本17和样本32 中，13号染色体的z值分别是4．09和10．19，18号染色体的z值分别是5．26和3．72， 21号染色体的z值分别是8．6l和3．72，表明基因组拷贝数变异的发生。有趣的是， IV 万方数据 硕士学位论文这两例无创产前检测结果显示非整倍体阳性患者均在肿物完全切除前病理确