课件：遗传疾病与基因治疗.ppt

* * * * * 基因诊断的基本原理 应用人类标准基因图谱或功能蛋白基因基因图谱与受试者的基因图谱进行比较、分析与预测，不论缺陷基因是否已经表达，便能鉴定缺陷基因的有无。 能够检测单个碱基置换、缺失和插入等 还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性 及早发现易感基因位点 基因诊断的基本方法 DNA点杂交 限制性内切酶图谱直接分析法 限制性片段长度多态性（RFLP）分析 寡聚核苷酸探针杂交分析法 PCR法 DNA点杂交 变性： 把受检者DNA变性成单链 转膜杂交：单链DNA直接点样在硝酸纤维膜上，与标记的基因探针作固相分子杂交， 检查结果：根据杂交结果是否是阳性及阳性强度，来检测基因是否存在以及基因的数目。 此法的优点：比较简便快捷，可适用于诊断基因缺失的遗传疾病。 例子：如正常人的细胞中有4个α珠蛋白基因，根据受检者DNA与P32标记的α珠蛋白基因探针杂交后再按放射自显影图上的强度与其α基因数量成正比的原理，便可检测出α珠蛋白基因是否缺失和缺失的程度，以确定有无地中海贫血症及该病的相应类型。 技术的关键：是克隆一批能用于检测人类遗传疾病基因诊断的探针，制作成为诊断芯片。 适用于典型遗传疾病 确知疾病基因 通过芯片探针检测 限制性内切酶图谱直接分析法 是应用专一性探针和限制酶，直接针对存在疾病基因内部的突变进行检测。 可检测出点突变导致的限制性位点的改变和包括大的DNA片段缺失和插入的基因序列的重排。 例子：限制酶MstⅡ所识别的DNA碱基序列是CCTGAGG，而这是正常β珠蛋白基因（βA）第六个密码子前后的碱基序列。 经MstⅡ切开形成1.15kb和0.2kb两个片段。 正常β珠蛋白基因突变成为镰形细胞贫血症基因（βS）时，第六个密码子GAG突变成为GTG，于是CCTGAGG变成CCTGTGG，而不能被MstⅡ所识别，以致酶切时产生1.35kb的DNA片段。 根据这一特点，可以对镰形细胞贫血症进行基因诊断 突变位点或易感基因 限制性片段长度多态性（RFLP）分析 利用人群个体的DNA碱基序列的多态性特征进行诊断。 大约每100~200个碱基中就有发生中性替代而出现多态性。多态性并不引起疾病，却影响到限制酶的切点改变。 RFLP呈孟德尔式遗传， RFLP作为染色体上疾病基因座位的标记基因，通过RFLP的连锁分析，对疾病进行间接诊断，来推测一个家庭成员和胎儿是否携带有遗传病。 我国在20世纪80年代中期已应用这一技术成功地进行了β地中海贫血病、苯丙酮尿症等遗传病的基因诊断。 RFLP连锁分析是一种十分有用的遗传病诊断技术，适用于诊断任何一种单基因遗传病。 即使突变的遗传病基因序列或基因产物还不清楚，但只要找到和突变基因连锁的RFLP基因座，就可以利用RFLP连锁分析进行遗传病的基因诊断和产前诊断。 有人提出如果建立起一套以20cM间隔的平均分布于整个基因组的RFLP基因座，并选用合适的探针，就有可能对所有的遗传病进行基因诊断。 易感基因，多态性 寡聚核苷酸探针杂交分析法 根据已知疾病基因突变结构和相应的正常基因结构，在体外人工合成一段16~19bp的疾病基因探针和同样大小的相应正常基因片段的寡聚核苷酸探针，并分别与被检者ＤＮＡ杂交，从而直接显示疾病基因是否存在以及存在的状态。 这一方法对遗传病进行诊断，既不受突变是否涉及限制酶切位点的限制，又不必预知患者父母是否生育过患儿，因此在产前诊断中更有价值。 ２０世纪８０年代末，上海儿童医院应用这一技术对上海等几个省市的β地中海贫血症家系进行了分析鉴定，并对高危妊娠胎儿进行产前基因诊断。 疾病直接诊断 基因治疗 概念：基因治疗（ gene therapy）是将具有防治功能的外源基因（目的基因）通过适当载体转移到患者的相应器官组织（靶组织），并进行表达，以获得防治疾病的疗法。 基本原理： 基因治疗是将外源基因作为药物导入体内靶组织，在体内表达产生特定的活性因子（如细胞因子等），也可以将其看做是导入一个具有治疗作用的给药系统。 条件： 1）获得目的基因； 2）选定靶组织； 3）确定将目的基因导入靶组织的方法和途径。 基因治疗途径 遗传病的基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因直接引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。 纠正的途径: 原位修复缺陷的基因， 用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以互补替代缺陷基因来发挥作用，一般利用基因芯片来实现。 基因治疗的基本步骤 目的基因获得 目的基因导入或转移 目的基因表达 目的基因的寿命 目的基因获得 疾病基因与疾病修复基因的比对 人工合成 基因文库钓取 cDNA合成 PCR合成 制作芯片 目的基因转移方法 病毒方法 非病毒方法 RNA和DNA病毒都可作为基因转移的载体。 常用的有反转录病毒载体和腺病