新型海洋微生物GH3家族β-葡萄糖苷酶基因的克隆与-中国科技论文在线.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT 9 GH3家族新型海洋微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及重组酶性质研究* 刘娟娟，方泽民，房伟，洪宇植，彭惠，张学成**，肖亚中** 安徽大学生命科学学院，生物工程研究中心，合肥（230039） Email: xiaoyz@ 摘要：从中国南海表层海水微生物宏基因组文库筛选到一β-葡萄糖苷酶阳性克隆pSB16D15，经亚克隆测序分析鉴定其含一新型GH3家族β-葡萄糖苷酶基因（bgl3）开发开放阅读框。bgl3由2535个核苷酸组成，G+C含量为43.03%，编码蛋白Bgl3由844个氨基酸组成，理论分子量为90, 807 Da，与来自Glaciecola sp. HTCC2999以及Alteromonas macleodii ATCC 27126的β-葡萄糖苷酶分别具有98%和61%的序列一致性。以pET22b(+)为载体，成功实现bgl3在E. coli BL21(DE3)细胞异源表达，并获得性质稳定的重组蛋白产物。理化性质分析表明，重组蛋白rBgl3氧化pNPG的最适pH为6.5-7.0，最适温度为45 ℃。rBgl3在pH 7.0到9.0范围内具有比较高的酶活力并具有较好的稳定性：35 ℃下保存1 h能保持至少90%的活力。在pH 7.0、45 ℃的条件下，rBgl3催化pNPG的比酶活为17.07 IU·mg-1，Km、Vmax分别为1.80 mM和0.81 μmol·min-1·mg-1。当溶液中有10 mmol/L Cu2+、Fe2+和Fe3+存在时，rBgl3的活性完全被抑制；葡萄糖、乙醇和EDTA对酶活性也有一定抑制作用。 关键词：β-葡萄糖苷酶，GH3家族，宏基因组文库 中图分类号： 0 引言 β-葡萄糖苷酶（Bgls, EC 1），是一类在亲核试剂间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖内部、带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间水解β-1,4-糖苷键。Bgls属于纤维素水解酶系，能与外切葡聚糖酶（EC 1）、内切葡聚糖酶（EC ）协同作用将纤维素彻底降解为葡萄糖[1]。β-葡萄糖苷酶是一类重要的工业用酶，潜在应用广泛，例如：对生物质的降解和生产燃料乙醇[2-4]；作为重要的风味酶，释放出茶叶、葡萄酒以及果汁中的风味成分，起到增香作用[5]；合成重要的糖配体[6]等等。 根据酶催化功能结构域的氨基酸序列和结构相似性，可将β-葡萄糖苷酶归类为糖基水解酶中的GH1、GH3和GH9三个家族，其中GH3家族主要分布于微生物中[7-13]。然而，许多蕴 * 本研究得到国家“863”计划项目（2007AA09Z421）；教育部博士点专项基金（20093401110006）和安徽省优秀青年科技基金（08040106908）资助。 藏着珍贵基因资源的微生物并不都能够进行纯培养。宏基因组技术通过直接分离未培养微生物基因组DNA（gDNA），与载体连接克隆到可培养微生物中，通过功能或序列筛选等方法筛选所需要的阳性克隆，提供了一种探知和获取未培养微生物新资源的方法。已经有很多文献报道通过构建宏基因组文库技术成功获得了新型酯酶、蛋白酶等[14, 15]。 通过功能筛选方法，我们前期从中国南海表层海水微生物宏基因组文库中筛选到六个具有β-葡萄糖苷酶生物活性的克隆。本文报道对其中一新型GH3家族阳性克隆pSB16D15的研究结果。 1实验材料 1.1 使用试剂 pNPG (p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)、RNase A购自Sigma公司；NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司；pEasy-T Vector、TransTaq-T购自Transgene公司；pUC19 DNA/BamH I 为MBI公司产品；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒为Axygen产品；七叶苷、柠檬酸铁铵购自BBI公司；其余试剂均为国产或进口分析纯产品。 1.2 实验菌株 E.coli JM109及BL21(DE3)为本实验室保存。 1.3 宏基因组文库构建 宏基因组文库的构建参考Chu等的方法[16]，采集南海海洋表层海水，分离微生物细胞，通过低熔点琼脂糖包埋裂解制备基因组DNA，获得的DNA利用Hind III进行部分酶切，回收50-150 kb的DNA片段，与BAC载体连接，构建海洋微生物宏基因组文库。 实验方法 2.1 β-葡萄糖苷酶阳性克隆的筛选 方法参照Feng Y等[15]，使用含有0.1%七叶苷和0.25%柠檬酸铁铵的LB固体功能筛选培养平板，将构建好的海洋微生物宏基因组文库影印至平板上，37 ℃倒置培养20 h，菌落周围有黑褐色反应圈的初步确定为阳性克隆。抽提阳性克隆质粒，电击转化至 E.coli EPI300，重新