单克隆抗体医学课件.ppt

4、阳性杂交瘤细胞的克隆培养 克隆对象：抗体阳性孔。 克隆化的原则：对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化。 克隆方法： 有限稀释法（辅以饲养层细胞） * 有限稀释法 有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔(96孔板) 0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落。有时为了加快克隆细胞生长速度，常采用腹腔巨噬细胞做饲养层细胞。 * 饲养细胞 在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过 程中，需要加入饲养细胞。常用的饲养细胞有： 小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞 或小鼠胸腺细胞。 * 饲养层细胞的作用 提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。 腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。 饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。 * 目的：保种。 方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。 复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中 5、 杂交瘤细胞的冻存与复苏 * 　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种： 体外法：使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。 体内法：体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。 6、单克隆抗体的大量生产 * 腹水的制备 　　　常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。 * 单克隆抗体 * 第一节、免疫学基础知识 抗原：可刺激机体产生免疫应答，并可与应答产物结合的外来“异物”。 抗原的两大特点：免疫原性、反应原性 抗原决定簇：又称抗原表位，指位于抗原表面或内部的、具有一定组成和结构的特殊化学基团，能与其相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的结构。 * * 佐剂：与抗原同时或预先注射，可非特异性地增加或改变机体对抗原免疫应答的一类物质称为佐剂。 种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌）是目前动物实验中最常用佐剂。 * 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。 * * B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞 脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes) 一般来讲，脾脏有三大功能： 1.它是 “血库”，当人体休息安静时，它贮存血液；当处于运动、失血、缺 氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量。 2.脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾 脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉。 3.脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。 * B淋巴细胞发育过程： 祖B淋巴细胞 前B淋巴细胞 成熟B淋巴细胞 抗原刺激、递呈细 胞和Th细胞作用 活化B淋巴细胞 分化为浆细胞 * 单克隆抗体：指由单一B细胞增殖分化形成的子代细胞(浆细胞)产生的只识别单一抗原决定簇的抗体。 多克隆抗体：由于一个抗原上往往有多个抗原决定族，会引起多种B细胞增殖、分化形成多种浆细胞，后者分泌的多种抗体混合在一起存在于机体的血清中，又称抗血清。 多抗：制备简单、免疫效果强大，但特异性差。 单抗：均一性好、特异性强。 * 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 长命 不分泌抗体 分泌抗体 短命 分泌抗体 长命 K?hler和Milstein 1984年Nobel医学奖 杂交瘤技术制备单抗的基本原理 第二节、单抗制备的技术流程 * * 骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则 ①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细