高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用99672.docVIP

HRM 介绍 HRM 技术是high-resolution melting analysis 即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR 技术，HRM 不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA 配型等的分析。 因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。 HRM 原理 HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。随着高精度PCR 仪（LightCycler? 480 和Rotor-Gene 6000 ）和饱和染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现，HRM 技术的普及使用成为可能。 HRM 应用 ???SNP（单核苷酸多态性）的筛查。 ???基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。 ???新突变的筛查。 ???甲基化的筛查。 ???遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 ???HLA 基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。 ???法医学鉴定、亲子鉴定。 ???动植物品质相关多态性位点的研究等。植物抗逆性，突变与性状关联性研究。 HRM 特点 ???高通量：1 次可同时检测10-384 样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。 ???高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000 个正常细胞中1 个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。检测灵敏性远高于“PCR+ 测序”的25% ，即100 个正常细胞中至少有25 个突变细胞，测序仅适用手术组织。 ???特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性高达100% 。直接未知杂合突变鉴定准确性100%，特异性100% 。直接未知纯合突变鉴定准确性96%， 利用非标记探针快速基因分型法直接未知纯合子鉴定准确性100%。 ???重复性好：重复性100%? ???使用范围广：不受碱基位点局限，除可检出已知突变外，也能检测出未知突变。 ???重复性好：样品PCR 和HRM 分析直接在同一管内进行，实现闭管操作，避免交叉污染。 ???操作简便：只需设计特异引物，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。 ???成本低：简化操作时间和步骤，大大降低成本，检测费用远少于测序、Taqman 探针技术。 ???标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。传统“PCR+ 测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。 ???其它：只检测PCR 样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR 样品，无污染，PCR 产物可以进行下游分析，非常适合于测序前的SNP、甲基化等预扫描筛查。 HRM 应用举例 ??SNP 检测 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs ），指单个核苷酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。SNP 在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。 HRM 检测SNP 技术是依据在一定的温度范围内将PCR 扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA 都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA 指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子（下图）。? 检测SNP 的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如Taqman 探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用PCR+ 测序的方法，成本高、操作繁复较低。 HRM 技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SNP 筛查的最佳选择。 SNP 检测方法比较 研究方法 优点 缺点 直接测序法 SNP分析的金标准能发现已知和未知SNP 位点 每个位点均需要经PCR 扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本做疾病关联分析，且容易交叉污染。 Taqman探针法 适合已知SNP 位点、位点数量少、通量高的检测? 价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知SNP 位点? 非探针普通PCR 方法