Shh在胃癌细胞系SGC-7901中的表达.pdfVIP

山西医科大学硕士学位论文 2．5I玎一PCR 2．5．1提取RNA X107个细胞加 (1)细胞经计数后加入离心管，然后5000rpm室温离心去上清液，每1 0．5mlTriz01． 中将样品移到无菌1．5ml离心管中。 pl氯仿剧烈振荡混匀30sec。 (3)入100 (4)用台式离心机，12000rpm，室温离心5min。 Il 1无水 (5)将上清液(约459 乙醇，混匀． 8000rpm室温离心lmin。 Soution，10000rpm室温离心30sec。 (8)重复(7)步骤一次。 |lIDEPC-H。0，室温放置2min。 2．5．2反转录聚合酶链式反应(reverse chainreaction) transcriptionpolymerase (1)Shh的引物序列是： 上游引物5，-ACCGAGGGCTGGGACGAAGA．3’ 下游引物5’-ATTTGC抡CGCCACCGAG]I-3’，扩增产物为211bp。 内参照13-actin引物序列是： 上游引物5’-CCTAGCACCATGAAGATCAA．3’ 下游引物57-AGCCATGCAAATGTCTCAT-3’，扩增产物为250 bp。 (2)逆转录反应 1．t u RibonucleaseInhibitorO．5p 总IⅢA4．01，dNTP混合物2．01，Rnasin l，下游 X ll ll 1(25111M)，10buffer2．0|IReverse 弓I物1．01，MgCl24．0 1，AMV |I u l，DEPC水至25 Reverse 冷却5min，使AMV Transcriptase失活。 (3)PCR反应 p p p u1lO 将上一反应所得混合物4．01，dNTP混合物0．41，上游引物1．0l，MgCl：0。8 X tl p ll cDNA buffer2．0 DNA聚合酶O．51，DEPC水至251，进行反应。ShhmRNA l，Tap 的PCR扩增条件为：94。C 4 山西医科大学硕士学位论文 的扩增条件为940Clmin，520C50see，720Clmin，35个循环，720c10min。 准确吸取上述PCR产物10pl，在2％琼脂糖凝胶中电泳(80V，30min)。 结果判定：在反射紫外灯下观察电泳条带，用数码相机摄影并进行吸光度扫描，以PCR产物 ／B．actin的吸光度比值表示其表达量。 2．5．3实验过程中注意事项： (1)所有稀释液均用无RNA酶的去离子水配制。 (2)实验前所用试剂均需用DEPC水处理。 (3)所用器皿需经1500C烤3h以上去除RNA酶。 3．统计学处理采用SPSSl2．O统计软件进行分析，pAeo．05为显著差异。 山西医科大学硕士学位论文