通过测定血浆和尿液中的肌酸和胍基乙酸来诊断肌酸代谢疾病.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT 6 通过测定血浆和尿液中的肌酸和胍基乙酸来诊断肌酸代谢疾病 Qin Sun和William E. O’Brien 摘要 肌酸代谢疾病包括肌酸运载体缺乏，还有参与肌酸合成的精氨酸-甘氨酸脒基转移酶（AGAT）和胍乙酸甲基转移酶（GAMT）这两种酶的缺乏。实验室对这些疾病的诊断依赖于血浆和尿液中肌酸和胍乙酸的测定。这里我们记述一种快速HPLC/MS/MS法，测量将分析物衍生化后经正相HILIC分离后的产物。 关键词：肌酸，胍基乙酸，精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，AGAT，胍基乙酸甲基转移酶，GAMT，肌酸运载体，质谱分析法 引言 肌酸和磷酸肌酸对于细胞内ATP能量池的时空调控至关重要（1-3）。人类从膳食来源和内源获得肌酸，后者通过精氨酸-甘氨酸脒基转移酶（AGAT）和胍乙酸甲基转移酶这两种酶参与的较短的两步法合成通路，提供高达50%的日常肌酸要求。在第一步中，精氨酸-甘氨酸脒基转移酶催化从甘氨酸和精氨酸合成鸟氨酸和胍基乙酸（GAA）。然后胍乙酸甲基转移酶把GAA转化成肌酸，此步反应需要s-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，而且是最大的SAM消耗反应。大部分肌酸合成发生在肾脏，然后由肌酸膜运载体接受（CRT）（4） 这些疾病涉及到肌酸合成和膜上肌酸运载体两者（5-10）。这些病都是罕见的，至今只有两例AGAT缺乏；一百多例GAMT缺乏和几例CRTR缺乏，但是很可能随着对这些病了解的增多，将发现更多的病例。婴儿期和童年期的病人表现为发育迟缓，肌张力减退，也出现过几例癫痫。对于GAMT缺乏的病人，在婴儿期肌酸处于低水平到正常限值内，但是如果先证者实行严格的素食，在青春期肌酸会下降。高血浆GAA浓度被认为能确诊GAMT缺乏。这些病人脑部的磁共振检查显示肌酸缺乏和磷酸胍乙酸累积（11）。对于AGAT缺乏，生物化学检测显示血浆中肌酸和肌酐量极低， GAA的浓度也低。通过测量羊水中的胍乙酸，产前诊断是可能的（12）。 肌酸运载体，在给脑、骨骼和心肌提供充足能量上起到重要作用，对肾脏再吸收肌酸也至关重要，也负责GAA的大脑分佈和摄取（13,14）。运载体由X染色体上的一个基因（SLC6A8）编码。这个基因的突变也在X相关智力迟钝的病人中发现（6, 7, 15–17）。生物化学变化在初发病例中表现为尿肌酸/肌酐的比值升高。有趣的是，在一碳甲基代谢被妨碍的紊乱中也报告了胍乙酸和/或肌酸排泄变化，例如，在s-腺苷甲硫氨酸水解酶缺乏和钴胺素缺乏的情况下（18,19）。 对乙酸和肌酸测定已报道过数种方法，如使用HPLC, GC/MS,和HPLC/串联MS（20-23）技术的方法。虽然用这些方法定量尿液中高浓度的胍乙酸和肌酸没有困难，但是难于准确测量AGAT缺乏时出现的低血浆胍乙酸浓度不够灵敏。我们描述了一种改良的串联MS方案，使用衍生分析和亲水交互作用柱（HILIC）。HILIC是正相色谱分析法的变体，用于分离非常极性的物质。这个方法足够灵敏，能测量低浓度的胍乙酸并能同时分析尿液和血浆的样品。 材料 标本要求 血浆样品（肝素钠抗凝）：立即离心样品并把血浆（0.5–1.0 mL）转移到标记的试管中。在-16℃或以下冷冻储存。样品应该在收集后的两周内分析。样品在收集地点和实验室之间的运输应该有干冰（见备注1） 尿液样品：冷冻2–5 ml尿液。标本可以冷冻储存2周。样品在收集地点和实验室之间的运输应该有干冰（见备注1）。 试剂 1%甲酸铵：在800ml HPLC级H2O中添加10ml甲酸，用浓氢氧化铵溶液调整pH到4.0，使总体积达到1升。在室温储存。可稳定2年。 HPLC运行缓冲液：包含0.05%甲酸铵的95%乙腈。在950ml乙腈中添加50ml 1%的甲酸铵溶液。在室温储存，可稳定2年。 衍生剂， 配制在正丁醇中的3N盐酸（Regis Technologies, Inc., Morton Grove, IL） 标准品和校准品 肌酸标准品一级储存液，6 mM：在50 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）中中添加44.75 mg肌酸。可冷冻（-16℃或以下）储存达2年。 肌酸标准品次级储存液，600 μM：用9 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）稀释1ml肌酸标准品一级储存液，使有效浓度为600 μM。冷冻储存可达1年（-1 肌酸质量控制溶液，7.6 mM：在50 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）中添加50 mg肌酸。 胍基乙酸标准品一级储存液，5 mM：在50 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）添加29.3 mg胍基乙酸。冷冻储存储备溶液可达2年（- 胍基乙酸标准品次级储存液，50 μM：把100μl储备溶液与9.9 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）混合稀释。