二抗的选择也决定了整个试验的成败.doc

二抗在免疫学实验中起着举足轻重的作用，二抗的选择也决定了整个实验的成败。实验中在选择二抗时必须注意以下几点： （1）一抗种属来源 主要根据一抗种属来源来决定确定二抗的类型，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可）。 （2）一抗类型 二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体. 单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。 如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。 在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。 （3）标记物的选择 一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用biotin/avidin检测系统。 下面简单介绍几种二抗探针的优缺点及其适用的实验： a. 酶：主要有两种不同的酶耦联物，HRP和AP。比较而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者更为灵敏，通常情况下，HRP广泛应用于免疫组化，western blot和ELISA中，而碱性磷酸酶（AP）更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和western blot. b. 荧光基团：FITC：FITC是广泛使用的荧光基团，但其最大的缺点是淬灭快，使用抗淬灭剂可以减轻。AMCA：常用在多标记实验中，如免疫荧光、流式细胞术。其缺点是，淬灭快，且由于肉眼不能很好的检测其所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更稳定，且在表面荧光显微镜下，Cy2的荧光FITC更强。Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。二者常在共聚焦显微实验中作多标记。但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。TRITC,RRX,TR:TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中，也可以使用RRX或TR，但TR会产生较高的背景。在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，且和这两者的重叠很少。PE：常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。 注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。 荧光素根据其发射波长可分为： 499nm， 蓝色荧光（Blue） 500-549nm，绿色荧光（Green） 550-584nm，黄色荧光（Yellow） 585-615nm，橙色荧光（Orange） 616-700nm，红色荧光（Red） =700nm， 远红外荧光（Far-Red） 几种新型荧光基团 荧光基团 颜色 激发光波长（nm） 发射光波长（nm） DyLight 488 493 518 DyLight 549 550 568 DyLight 649 646 674 DyLight 680 Near Red 682 715 DyLight 800 Infrared 770 794 ???????? ????????? 荧光亮度更强 ????????? 发光更持久 适合于荧光拍照 ????????? 灵敏度更高 ????????? 高信噪比、低背景 ????????? 稳定性更好 适用于pH4～9的各种缓冲系统中 c. 生物素：生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/链酶亲和素（avidin/streptavidin）发生不可逆反应而紧密结合在一起。首先加入生物素标记的二抗，在加入耦联有酶或荧光集团的avidin或streptavidin，后者能够结合于二抗表面的多个位点上，从而极大的放大检测信号。