猪瘟感染对外周血单个核细胞凋亡的影响-东北畜牧兽医网.PDF

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　２０１７（０３上）：１５９－１６２ 猪瘟感染对外周血单个核细胞凋亡的影响 诸葛增玉，张俊星 （天津农学院动物科学与动物医学学院，天津３００３８４） 中图分类号：Ｓ８５８．２８；Ｒ３３１．１ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００４－７０３４（２０１７）０３－０１５９－０４ 关键词：猪瘟；外周血单个核细胞；凋亡；ＭＴＴ；ＥＬＩＳＡ；ＰＣＲ 摘　要：为了揭示猪瘟病毒感染致细胞凋亡的分子机制，试验采用ＭＴＴ法观察猪瘟病毒感染单个核 细胞的凋亡情况，采用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法检测凋亡相关基因转录水平的差异。结果表明：细胞的增殖 活性被猪瘟病毒抑制，并且这种抑制作用随着培养时间的延长而增强，７２小时时最大达到３９．９０％。 感染后细胞产生的Ｃｙｔ－ｃ增至正常细胞的５倍，ｃａｓｐａｓｅ－３和ｃａｓｐａｓｅ－９达到对照组的１５．７倍和１８ 倍，Ｂｃｌ－２和Ｔｒａｉｌ－Ｒ２表达量降低，Ｆａｓ含量明显升高；ｃａｓｐａｓｅ－８蛋白增至３倍但基因表达无明显 变化。说明感染猪瘟病毒可能影响多种细胞凋亡途径，包括线粒体、内质网和死亡受体途径。 　　猪瘟具有高度传染性、高致病性和极高致死率， 猪瘟活疫苗，兽药生字 （２０１２）１１０５７１００４，购自 给养猪业造成严重破坏。我国因疾病死亡的生猪中 浙江诺倍威生物技术有限公司。 １／３以上由猪瘟导致，每年直接经济损失达百亿人民 １．３　主要试剂 ［１］ 猪淋巴细胞分离液（聚蔗糖 －泛影葡胺）、胎牛 币，导致巨大的人力和资源浪费 。猪瘟病毒（Ｃｌａｓ ｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）很少导致细胞病变，可 血清，Ｓｉｇｍａ公司生产；ＲＰＭＩ１６４０培养液，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 有效地逃避宿主免疫系统，并且对免疫细胞有很高的 公司生产；ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值 ７．２～７．４）， 亲和性，尤其是对外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ 自配。 ［２］ １．４　ＰＢＭＣ的提取 ｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）的功能有很大影响 。 这些细胞是猪瘟感染和复制的靶细胞，在对抗外来病 采用泛影葡胺密度梯度法。于猪前腔静脉取血， 毒入侵和感染的免疫系统中起到了关键作用，感染后 放入１０％ 柠檬酸葡萄糖抗凝管中。在 １０ｍＬ离心 ［３］ 管中加入３ｍＬ淋巴细胞分离液；取１．５ｍＬ抗凝血与 通常引起猪淋巴细胞大量减少 。研究表明，猪瘟 急性感染是通过细胞凋亡的方式引起外周血白细胞 等量ＰＢＳ充分混匀，用微量移液管沿管壁缓慢叠加 各亚群细胞和外周免疫组织中淋巴细胞大量减少的， 于分层液面上，保持清楚的界面；６００ｇ／ｍｉｎ水平离心 从而影响初期宿主的抗病毒免疫［４］。 ２０ｍｉｎ后管内分为３层，吸取上层和中层接触面处的 细胞凋亡是受基因控制激活细胞主动死亡的正 白色薄层，即得ＰＢＭＣ；加入ＲＰＭＩ１６４０培养液，４℃、 常生理过程，具有调节组织内环境稳定的功能。异常 ６００ｇ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ，洗涤２次。细胞计数并用台 的细胞凋亡往往导致疾病，诱导细胞凋亡是病毒致病 盼蓝染液检测（细胞存活率在９９％以上）。 的重要机制之一。ＣＳＦＶ感染诱导淋巴细胞凋亡可能 １．５　细胞培养和分组 有两种方式：一是直接诱导淋巴细胞的凋亡；二是间 用ＲＰＭＩ１６４０培养液稀释提取的ＰＢＭＣ，调整细 ６ 接诱导巨噬细胞释放一种或多种细胞因子，从而使相 胞浓度为 ２×１０ 个／ｍＬ，加入病毒，至终浓度为 ［５］