抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕-中国科技论文在线.PDF

中团粟针 太警 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2005，36(1)：63～68 63 抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白 在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定 苏志坚 ，吴晓萍 ，郑 青 ，黄亚东 ，庞实锋2，冯 雅2，李校垄r ( 暨南大学药学院； 暨南大学医药生物技术研究开发中心，广州510632) 【摘 要】 目的：构建和表达一种抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白，在创伤皮肤表面应用 时能裂解成有功能的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子，预防伤口感染和促进皮肤修复。方法：利用PCR技 术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因。再将两者作为模 板，用PCR方法扩增出编码融合蛋白的DNA。将该DNA片段插入到载体pPICZ~ 中，并利用电转法将质粒转入 毕赤酵母smdl168中，Zeoein抗性筛选重组转化子。甲醇诱导96 h，SDS电泳检测融合蛋白的表达，并用 Western-blot杂交检测融合蛋白的免疫原性。利用肝素亲和层析纯化融合蛋白，同时检测融合蛋白的抑菌和促 3T3Bal／b细胞分裂活性。结果：筛选出能表达相对分子质量约为19 kD融合蛋白的重组转化株，SDS电泳 检测显示甲醇诱导96 h后，融合蛋白表达量达到最高，且能与人酸性成纤维细胞生长因子抗体产生免疫反应。 融合蛋白没有抑菌活性，而裂解产物则具有抑菌活性。此外，融合蛋白的促细胞分裂活性与野生型人酸性成纤 维细胞生长因子相比没有明显的降低。结论：获得含凝血酶切割位点的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的 融合蛋白，并在毕赤酵母中实现了表达。融合蛋白的裂解产物具有抑菌活性。 【关键词】抗菌肽；人酸性成纤维细胞生长因子；融合蛋白；毕赤酵母；构建；表达 【中图分类号】Q503 【文献标识码】 A 【文章编号】 1000-5048(2005)01—0063—06 人类自20世纪6o年代起就发现昆虫体内具 影响l ，引。为了更好地发挥两种多肽各自的生物 有高效的免疫系统，开始研究昆虫体内的抗菌因 功能，同时考虑到人体伤口处具有多种凝血酶，本 子l1 J。抗菌肽(cecmpin)是最先被发现的一类短 研究将具有抗菌功能的抗菌肽和具有皮肤修复功 肽，其具有广谱抗细菌、真菌和部分病毒的能力。 能的人酸性成纤维细胞生长因子融合在一起，并在 此外，抗菌肽还具有无残留毒性及病原体难以产生 两种多肽问加入凝血酶蛋白切割位点(LVPRAS)， 抗药性等优点。作为一类极具潜力的新抗菌药，抗 构建成新型的融合蛋白，目的是使融合蛋白在人体 菌肽具有优越的应用前景l2’3 J。 伤口应用时能自动裂解成同时具抗菌和皮肤修复 人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast 功能的多肽。 growth factor，aFGF)是成纤维细胞生长因子家族中 1 材 料 的主要成员之一，由154个氨基酸组成。作为多种 类型细胞的丝裂原，aFGF可用于创伤修复、心脑血 1．1 菌株和质粒 管疾病治疗和神经系统疾病治疗等，特别在烧伤、 大肠杆菌Top 10F 、毕赤酵母(Pichia pastoris) 创伤修复方面临床应用甚广l J。 宿主菌smdl168以及表达载体pPIcz以(Invitrogen 研究表明，抗菌肽的N端对其杀菌活性起着 公司)；含有人酸性成纤维细胞生长因子DNA序列 关键作用，增加3个氨基酸就能使其杀菌活性完全 的重组表达质粒pET—aFGFl9．154(本实验室构建并保