简化的两步法细菌内同源重组腺病毒表达载体重.doc

PAGE PAGE 1 简化的两步法细菌内同源重组腺病毒表达载体重 邹昌勇，全家妩Δ，田生和，杨京生，吴季南中华医药杂志 作者单位：430060湖北武汉，武汉生物制品研究所 【摘要】目的应用细菌内同源重组高效制备p53基因重组腺病毒。方法设计引物扩增p53基因，在上下游引物分别引入Xhol和HindⅢ酶切位点，将p53基因亚克隆连接到经相同酶切的pshuttle-cmv转移质粒上，转化DH5α筛选卡那霉素抗性菌落构建重组腺病毒转移质粒pshuttle-cmv-p53用Pmel酶切线性化采用两步法进行同源重组：先将腺病毒骨架质料pAdEasy-1转化氯化钙法制备的BJ5183感受态细菌，筛选得到链霉素和氨苄青霉素抗性的AdBJ5183转化菌；再将线性化的pshuttle-cmv-p53转化氯化钙法制备的AdBJ5183感受态细菌，在细菌内进行同源重组，挑选卡那霉素抗性菌落培养并提取质粒，琼脂糖电泳挑选大片断的重组质粒pAdBJ5183-P53分别用限制性内切酶PacI和BstXI及PCR法鉴定。结果成功构建了p53基因重组腺病毒表达载体。结论采用简化的两步氯化钙化学转化法可以取代电穿孔法高效构建重组腺病毒表达载体。 【关键词】腺病毒载体；同源重组；p53基因 Constructionofrecombinantadenoviralvectorcarryingwt-p53genebysimplifiedtwo-stephomologousrecombinationinbacteria ZOUChang-yong，QUANGJia-wu，TIANSheng-he，etal.WuhanInstituteofBiologicalProducts，Wuhan430060，China 【Abstract】ObjectiveToconstructrecombinantreplication-defectivehumanadenovirusserotype5vectorcarryingwt-p53genebysimplifiedtwo-stephomologousrecombinationprotocolinbacteria.Methodswt-p53genewasfirstlysubclonedintoatransfervectorpshuttle-cmvandthepositiverecombinantpshuttle-p53waslinearizedbyPmeI.Thenthesimplifiedtwo-stephomologousrecombinationprotocolwasemployedfortheconstructionofrecombinantadenoviralvector.Instepone，adenoviralskeletalplasmidpAdeasy-1wastransformedintoBJ5183competentcellsbycalciumchloridechemicalmethedtoobtainpAdBJ5183;andinsteptwo，linearizedpsh-p53plasmidwastransformedintopAdBJ5183.ThepossiblepositiveadenoviralplasmidswereselectedbyagarosegelelectrophoresisandindentifiedbyPacIaswellasBxtXIcleavedpattern.ResultsReplication-defectiverecombinatantadenoviruscontaininghumanp53genewassuccessfullyconstructed.ConclusionTheresultsindicatedthatthecalciumchloridechemicallysimplifiedtwo-stephomologousrecombinationprotocolcanreplacetheco-transformationbyelectroperforationandmayhavebroaedutilityinsystemthatinvolvehomologousrecombinationinbacteria. 【Keywords】adenoviralvector;homologousreombination;p53gene 复制缺陷型腺病毒可以高效介导基因的体内外转移；感染细胞范围广，不但可以感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞；感染细胞时其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全可靠。因此成为基因治疗中常用的载体。重组腺病毒载体的构建方法有真核细胞内质粒重组法、酵