甲胎蛋白时间分辨荧光免疫分析.doc

PAGE PAGE 1 甲胎蛋白时间分辨荧光免疫分析 黄飚肖华龙朱利国谭成蔡刚明金坚 近年发展的时间分辨荧光测量技术以稀土离子为示踪材料，具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点。我们采用时间分辨荧光测量技术，建立了AFP时间分辨荧光免疫分析（time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）。 一、材料与方法 1.材料与试剂：抗AFP单克隆抗体A137和A47由无锡市第二制药厂提供。Eu3+标记盒、Eu3+发光增强液、AFPTRFIA药盒和AFP参考标准，EGamp;G-Wallac产品。CA199、CA125和CA153参考标准，CIBACORNING产品。AFP质量控制血清（L：21～35μg/L；M：62～93μg/L；H：173.4～260.2μg/L），中国药品生物制品鉴定所产品。全自动TRFIA检测仪（AutoDELFIA1235）为EGamp;G-Wallac产品。 2.固相抗体制备：将A47单抗用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液,微孔板各孔加200μl，4℃放置过夜。BSA封闭后真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。 3.Eu3+-A137制备：参照Eu3+标记盒说明书操作。取溶解于0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液A137（2g/L）500μl加入含0.2mg的Eu3+-N2-［p-异氰酸-苄基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu3+-DTTA）冻干粉的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20h。反应液经用80mmol/LTris-HClpH7.8缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱（1cm×40cm）层析，A280监测收集蛋白峰。 4.测定方法：采用平衡法建立AFP-TRFIA，即在包被有A47的96孔微孔板上，每孔依次加入25μlAFP参考标准或待测血清，200μl以反应缓冲液1:1000稀释的Eu3+-A137，25℃振荡孵育1h后，用洗涤液洗涤6次。再加增强液200μl，25℃振荡反应5min，荧光检测。全部过程均在AutoDELFIA1235上自动完成，软件设置由本所自编。 5.数据分析和统计处理：AFP-TRFIA标准曲线由AutoDEFIA1235自带的Log-Logit函数处理。精密度图和可测范围分析用吴德福IRMA数据处理软件。统计学处理用t检验。 二、结果 1.Eu3+-A137的理化和免疫学鉴定：Eu3+-A137以EGamp;G-Wallac提供的Eu3+标准为参考，平均每个A137IgG上连接了7.52个Eu3+，产率达53.07%。选择AFP参考标准高点（1000μg/L），Eu3+-A1371:1000稀释，进行TRFIA，Bmax/T为6.65%，与低点（1μg/L）的发光计数差达2个数量级以上。被测物和反应发光计数基本成算术级数正比关系。 2.AFP-TRFIA的考核：经Log-Logit函数处理程序处理得AFP-TRFIA标准曲线。(1)方法的特异性：将CEA、CA199、CA125和CA153分别配成10～500U/ml、15.8～409U/ml、12.1～732U/ml和27.7～243U/ml一系列不同浓度，代替标准曲线中的AFP参考标准。在上述浓度范围内，CEA、CA199、CA125和CA153对AFP-TRFIA均无交叉反应。(2)精密度和回收率：本方法的批内和批间CV分别为1.59%和7.14%，8批标准曲线的ABCV均小于0.0114，精密度图显示可测范围为4.22～1210μg/L，回收率为103.98%。(3)灵敏度和稳定性：以零剂量点发光值均值加2s后的发光值在标准曲线上得到的相应值为0.43μg/L。8条不同时间进行的AFP-TRFIA的效点均值ED20、ED50和ED80分别为（4.25±0.21)μg/L、（35.59±0.19)μg/L和（246.90±0.96)μg/L。 三、讨论 TRFIA测量仪已进入第三代，分析技术已实现高度自动化。我们所建方法适于测量血清AFP的含量，Eu3+-A137经标准曲线比较鉴定，免疫反应性基本无损失；其冻干品-30℃保存13个月后免疫反应参数基本未改变。用国家指定的AFP质控血清作样品进行分析，L、M和H分别为28.0μg/L、77.5μg/L和216.8μg/L，符合质控要求。我们曾把高含量的AFP血清样品经1:10～1000稀释后用于本方法的测定，换算后的AFP含量非常接近；用该系列稀释血清代替AFP参考标准作标准曲线，其斜率与AFP的标准曲线斜率基本一致，表明AFP-TRFIA有良好的健全性，血清基质对本方法没有明显影响。8孔