PCR反应原理及步骤.doc

PAGE PAGE 1 PCR反应原理及步骤 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链，在DNA聚合酶与引发子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做引发子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR反应步骤 　　 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的”半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 TaqDNA聚合酶 　　现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR的反应动力学 　　PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现”停滞效应”这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 标准的PCR反应体系 　　　　　　10×扩增缓冲液　5ul 　　　　　　4种dNTP混合物　各200μmol/L 　　　　　　引物　　　　　各10～100pmol　 　　　　　　模板DNA　　　　0.1～2μg　 　　　　　　TaqDNA聚合酶　1～2U 　　　　　　Mg2+　　　　　　1.5～2.0mmol/L 　　　　　　加双或三蒸水至　50μl PCR反应五要素 *引物（Primer） *酶（TaqDNAPolymerase） *dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） *模板（Template） *Mg2+（Magnesium） 　　引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 　 设计引物应遵循以下原则： 1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’’’’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 4、引物3’’’’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 5、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 6、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 7、引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度　 　　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水