课件：HXY-第二章-基因工程的载体和工具酶.ppt

在包装的时候， ?噬菌体具有位点特异的末端酶（terminase）体系（Ter体系），识别cos位点，把多联体切成单个?DNA长度。 两个cos位点之间，必须保持38—45kb的DNA，Ter体系才能识别。 Ter体系： 包装限制： * ①用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。 （6）cosmid克隆的一般过程 ②用同样的内切酶消化cosmid载体。 产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、长度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。 ③连接 * 切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。 注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。 ⑤感染大肠杆菌 ④ Ter体系识别并切割 * * * Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone * * 大质粒！ * ①载体片断自我连接。 ②外源DNA片断自我连接。 ③多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体。 （7）cosmid载体克隆的缺点 用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5’端的磷酸，可防止载体自体连接。 克服载体自体连接的改良方案： * 第三节 大分子DNA克隆载体 A.W.Murray 1983年形成基础理论, D.T.Burke等1987年变为现实。 一、酵母人工染色体 1. YAC的特点： （1）只能在酵母细胞中扩增。 （yeast artificial chromosome, YAC) （2）克隆容量大，为230kb-1700kb。 （3）构建原理：按染色体结构构建。 * （1）DNA复制起始点（ori） 2. 染色体复制和遗传的三个基本组件： TEL TEL CEN ORI （2）着丝粒（centromere，cen） （3）两个端粒（telomeres，tel） * Leu ARS CEN Leu- Yeast 后代死 Leu- Yeast 80%后代死 Leu- Yeast 后代活 Leu- Yeast 后代死 Leu- Yeast 后代活 Tel Tel * （1）着丝粒区（CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的组成结构 酵母染色体着丝粒区的保守序列 78-86bp I II III 由三个区组成 * 酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列： * 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。 （3）复制起点（ORI） 约100bp的自主复制序列（ARS）。 （2）端粒（TEL） 人是TTAGGG重复序列; 四膜虫是 GGGTTG重复序列。 （真核生物中只有酵母菌有ARS） * 位于 SUP4 基因内部。 （4）克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。 * TRP1、URA3（分别位于两臂）。 细菌的复制起点 ori和抗生素标记Ampr （5）在酵母中的标记基因 （6）在细菌中操作 * 4. YAC克隆外源DNA URA3 TRP1 CEN4 * Cloning by the yeast artificial chromosome (YAC) vector Essential components of YAC vectors 1 Centromers (CEN), telomeres (TEL) and autonomous replicating sequence (ARS) for proliferation in the host cell. 2 ampr for selective amplification and markers such as TRP1 and URA3 for identifying cells containing the YAC vector. 3 Recognition sites of restriction enzymes (e.g., EcoRI and BamHI) * （1）宿主酵母菌： 只有同时得到YAC的两个臂，才能在基本培养基（不加TRP和URA）上生长。 （2）选择方式 5. YAC转化过程 trp- 和 ura- cen ura3 trp1 * * （1）存在插入子的稳定性问题 6. YAC的缺点： （2）同一酵母细胞内多个YAC引起交换 （3）转化效率低 （4）难以制备纯的YAC-DNA * H. Shizuya等1992年在大肠杆菌F因子的基础上构建的。 （2）克隆容量可达300kb。 二、细菌人工染色体（BAC） 1. F质粒的特点： 每细胞只有一个拷贝，不会重组。 （4）便于提