课件：液相2010中国药品检验标准操作规程杂质检测,流动相比例调节.pptVIP

4.3 色谱柱的使用与保存 根据实验要求和流动相的pH值范围，参照色谱柱说明书，选用适宜的色谱柱。安装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。除另有规定外，不宜反向使用，否则会导致色谱柱柱效明显降低，无法恢复。进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡。经色谱系统适用性试验测试，应符合要求。 色谱柱在使用过程中，应避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者机械震动都会影响柱内定相的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流动相流速时应该缓慢进行。 试验结束后，可按色谱柱的使用说明书，对色谱柱进行冲洗和保存。 一般来讲，对于反相色谱柱，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在试验结束后，应用10倍柱体积（如150mm柱长，约15ml）的低浓度的甲醇/乙腈-水溶液（10%～20%）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用较高浓度的甲醇/乙腈-水溶液（50%）冲洗，最后用高浓度的甲醇/乙腈-水溶液（80% ～100%）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。 如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于甲醇或乙腈中，正相柱可以贮存于经脱水处理后的正己烷中，离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化纳的水中，并将色谱柱两端密封，以免干燥，室温保存。 4.4 流动相的调整 为满足色谱柱系统适用性要求，试验中有时需要调整流动相组分的比例。在调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过±30%且绝对改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过10%时，则改变量以±10%为限。下面举例说明。 4.4.1 二元流动相系统 例1 两组分比例为50：50 按上述原则，50%的最大相对该变量为15%，已超过了绝对改变量允许的范围，故该流动相比例调节的范围是±10%，即40：60至60:40。 例2 两组分比例为2:98 按上述原则，2%的最大相对改变量为0.6%，故该流动相比例调节的范围是1.4:98.6至2.6:97.4。 4.4.2 三元流动相系统 例3 三组分比例为60:35:5 按上述原则，可每次调节流动相系统中比例较低的两个组分。 对于35%的组分，其最大相对改变量为10.5%，已超过了绝对该变量允许的范围，故该组分比例调节的范围是±10%，即25% ～45%，则流动相系统比例的调节范围是50:45:5至70:25:5。 对于5%的组分，其最大相对改变量为1.5%，该组分比例调节的范围是±1.5%，即3.5% ～6.5%，则流动相系统比例的调节范围是58.5:35:6.5至61.5:35:3.5。 4.5 杂质检查时色谱参数的设置 在进行杂质检查时，选择适宜的检测灵敏度和设定适宜的积分参数非常重要。国内药品质量标准中，通常制备与杂质限度相当浓度的对照溶液，用以调节检测灵敏度，使对照溶液的主成分色谱峰高达满量程的10% ～25%，再进行供试品溶液的测定，以峰面积计算单个杂质量和总杂质量。 目前国内色谱数据处理系统大致有积分仪和色谱工作站两种类型，对于传统的积分仪，由于记录仪的满量程是固定的，因此检测灵敏度的调节通常是调节检测器的灵敏度使色谱峰高达到记录仪满量程的某个范围；而对于色谱工作站，由于记录标尺的满刻度是可调的所以通常是调节满刻度的设定值，使色谱峰的量程占满刻度的某个范围。 无论使用的是积分仪，或者是色谱工作站，如质量标准中没有明确规定峰面积的取舍限值，或没有设定灵敏度测试溶液，则在实际检验中，实验者通常根据以往经验设定积分参数和最小峰面积，由此也出现了同批样品的杂志总量在不同实验室（或不同实验者）之间差异较大的现象。 如遇到这种情况，建议实验者在检测灵敏度调节（或工作站标尺量程调整）完毕后，采用对照溶液逐步稀释法配制系统溶液来确定此色谱系统的检测限，在与供试品溶液及对照溶液相同的标尺下记录色谱图，通常以信噪比3:1时的相应浓度作为检测限，以该检测限对应的峰面积作为计算杂志总量时色谱峰峰面积的取舍限值。 4.6 梯度洗脱 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求高，以保证良好的重现性。要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时须特别小心。 混合溶剂的黏度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水黏度都小，当二者以相近比例混合时黏度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱承受的最大压力。 样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，如洗脱过程中基线漂移较大，亦可对色谱图进行空白扣除处理。 后面内容直接删除就行