死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法.doc

PAGE PAGE 1 死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法 【摘要】目的：建立甲基化特异性PCR（MSP）技术检测死亡相关蛋白激酶（DAPK）基因启动子甲基化。方法：设计针对DAPK基因启动子的MSP引物，建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测，评价其特异性、重复性和灵敏性，并经测序鉴定。结果：所建立的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板，不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板；对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测，其最大敏感性可达2％；在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致。结论：成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，可用于肿瘤标本的批量检测。 【关键词】死亡相关蛋白激酶;甲基化特异性PCR;甲基化 Establishmentandpreliminaryapplificationofmethylation瞫pecificPCRfor detectingmethylationofdeath瞐ssociatedproteinkinasepromoter WANGYa瞝i1,YAODong瞞ing1,LINJiang1,QIANJun1,XUWen瞨ong2, QIANZhen1,ZHUZhao瞙ui1,XIAOGao瞗ei1,WUChao瞴ang1，JIANGPeng瞔heng3 (1.DepartmentofHematology,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212002;2.SchoolofMedicalTechnology,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;3.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212002,China) ［Abstract］Objective:Toestablishthemethylation瞫pecificPCR(MSP)forthedetectionofpromotermethylationofdeath瞐ssociatedproteinkinase(DAPK)gene.Methods：TheprimersofMSPaimingattheDAPKpromoterweredesigned.MSPwasestablishedtodetectthemethylationpositiveDNAtemplates.Thespecificity,sensibilityandrepeatabilitywereevaluated.Results：TheestablishedmethylatedMSPcouldonlyamplifythemethylationpositiveDNAtemplate,butnottheunmethylatedDNAtemplateandunmodifiedDNAtemplate.Inaseriesofdilution,methylatedMSPcoulddetect2%methylationpositiveDNAtemplates.Theamplifiedresultsofsamesamplewereidenticalondifferenttime.Conclusion：ThemethylatedMSPtechniquefordetectingofDAPKmethylationwasestablishedsuccessfullyandcanbeusedforanalyzingsamplesfromcancerpatients. ［Keywords］death瞐ssociatedproteinkinase;methylation瞫pecificPCR;methylation 死亡相关蛋白激酶(death瞐ssociatedproteinkinase,DAPK)是一种相对分子质量为160kDa的钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，DAPK是一种正性细胞凋亡调节因子，作为抑癌基因通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡，动物模型研究发现DAPK能够在肿瘤发育的早期阶段抑制细胞转化、并且能够抑制晚期转移事件［1］。近年来对造血系统肿瘤的研究揭示伯基特淋巴瘤（BL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫大B细胞性淋巴瘤（DLBCL）［2,3］、急性髓细胞白血病（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）［4］、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）［5］同样存在着较高频率的DAPK基因启动子甲基化。此外，研究发现DAPK基因启动子异常甲基化与消化道、泌尿