基于血脑屏障Claudins基因调控的冰片、麝香酮开窍机制研究及安全性评价-药理学专业论文.docxVIP

解放军医学院硕士学位论文 解放军医学院硕士学位论文 万方数据 万方数据 中英文缩略词表 （Abbreviations and acronyms） BBB Blood brain barrier 血脑屏障 hpf Hours post-fertilization 受精后小时数 CNS Central nervous system 中枢神经系统 TJ Tight Junction 紧密连接 BMEC Brain micro-vessel endothelia cell 脑微血管内皮细胞 EB Evans blue 伊文思兰 DMSO Dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 LD50 The median lethal dose 半数致死剂量 ZO Zonula Occludens 闭锁小带 CMC-Na Sodium carboxyl methyl cellulose 羧甲基纤维素钠 TEM Transmission electron microscope 透射电子显微镜 bp Base pair 碱基对 A Absorbance value 吸光度值 DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 DEPC Diethy pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 dNTP Deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核苷 RT-qPCR Real-time quantitative PCR 实时荧光定量聚合 WISH Whole in situ hybridization 整体原位杂交 Amp＋ Ampicilin resistance 氨苄青霉素抗性 LSD Least significance difference 最小显著差法 MAPK Mitogen-activated protein kinase 丝裂原活化蛋白激 PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 kD Kilo Dalton 千道尔顿 1 作 者：陈怡君 学科专业：药理学 导 师：刘萍 基于血脑屏障 Claudins 基因调控的冰片、 麝香酮开窍机制研究及安全性评价 中文摘要 目的：研究中药开窍药冰片和麝香酮对斑马鱼血脑屏障超微结构及其紧密连接蛋白 Claudins 表达的影响，以阐明冰片和麝香酮开启血脑屏障的机制。利用斑马鱼胚胎 对冰片和麝香酮的安全性进行评价。 方法：给成年斑马鱼腹腔注射麝香酮（给予冰片后血脑屏障超微结构的观察之前 的研究者已做过），利用透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构的变化；实时荧光 定量 PCR 和整体原位杂交技术探讨冰片和麝香酮对斑马鱼紧密连接蛋白 Claudins 表达的影响以及下调明显基因不同时间点表达的变化。受精后 3h（3hpf）斑马鱼 在含冰片和麝香酮不同浓度的胚胎养殖水液暴露，在 8，24，48，72 和 96hpf 用显 微镜观察胚胎发育形态，测定 24hpf 自主抽动次数，48hpf 心率、孵化率、畸形率 和死亡率，RT-qPCR 法检测 96hpf 胚胎 sepn1 基因表达的情况。 结果：在给予麝香酮后，BBB 的基膜出现断裂，膨大的现象，紧密连接结构疏松， 内皮细胞出现皱缩，随着给药时间的增长，BBB 疏松越明显(与冰片结果一致)；冰 片或麝香酮作用 1h 后，大部分基因表达下调，其中 Claudin-5a，-12 在冰片中下调 明显，Claudin-2，-5a，-7b 在麝香酮中下调明显。Claudin-5a 在冰片作用后，1h 下 调最为明显，6h 后表达恢复。麝香酮作用的 4h 之间，Claudin-2，-5a，-7b 表达先 短暂上调，后下调，1h 下调最显著，然后又恢复，其中 Claudin-5a 在 4h 时恢复至 正常水平。冰片和麝香酮对斑马鱼胚胎 24hpf 时自主抽动次数，48hpf 心率，孵化 率，畸形率，死亡率都存在不同程度的影响；48hpf 以后都出现脊柱弯曲、心囊水 肿、卵黄囊水肿，游泳异常的毒性症状；冰片使胚胎的 sepn1 基因表达上调 （P0.05）。麝香酮使 sepn1 基因表达明显下调（p0.01）。 结论：冰片和麝香酮能使紧密连接蛋白 Claudins 家族基因表达下调，致使紧密连接 2 结构疏松，加之基膜结构破坏，内皮细胞皱缩，使得血脑屏障的屏障作用减弱，从 而开启血脑屏障。基因可逆性的下调说明冰片和麝香酮对 BBB 的开启是生理性的， 对脑部不会带来病理学损伤。从用药安全性来看，高浓度的冰片和麝香酮对斑马鱼 胚胎发育有明显毒性作用。 关键词：冰片；麝香酮；血脑屏障；超微结构；Claudins；胚胎发育 3 Resuscitativ