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( ) 第 31 卷 分析化学 FENXI HUAXUE 　研究报告 第 9 期 　　　　　　　　　　 　 　　　　　　　　 　　　 2003 年 9 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1030～1035 一种基于分子信标荧光探针快速检测烟草花叶病毒的新方法 刘凌凤　王柯敏 　谭蔚泓　李　军　孟祥贤　郭秋平 唐志文　刘选明　李　杜 (湖南大学生物技术研究院 ,化学化工学院 ,化学生物传感与计量学国家重点实验室 ,长沙 410082) 摘 　要 　研究了一种利用新型荧光探针 ———分子信标进行植物病毒检测的方法 ,可以不要求对病毒 RNA 进 ( ) 行严格的分离和纯化 ,就能快捷地得到检测结果。此方法被用于烟草花叶病毒 tobacco mosaic virus ,TMV 基因 组 RNA 的检测 ,为植物病毒分子生物学的研究提供了新的手段。 关键词 　分子信标 ,烟草花叶病毒 ,核糖核酸 1 　引　　言 植物病毒的鉴定和检测在病毒防治中是非常重要的 。RTPCR (reverse transcriptasepolymerase chain ) reaction ,逆转录聚合酶链反应 扩增技术是目前植物病毒的最有效和最灵敏的检测方法 , 并已经得到广 泛的应用1 。标准RTPCR 技术要求制备高质量的核酸模板 ,然而在提取核酸的过程中 ,大多数的提取 方法都不能完全除掉来自植物组织的多糖和多酚类化合物 ,而这些物质对随后的 PCR 或 RTPCR 扩增 反应有直接的抑制作用2 ,3 ,使得高质量核酸模板的制备成为 RTPCR 应用于常规诊断的主要限制因 素。因此 ,有必要发展一种简易的直接检测病毒基因组的分析方法。 分子信标是一种新型荧光分子探针4 , 由于它所具有的高选择性、高灵敏度和背景干扰低等优越 性 ,可以不需分离就能直接检测目标核酸序列。目前已在基因芯片的制备、单核苷酸多态性、突变基因 的诊断、活体细胞中mRNA 的监测等方面得到了广泛应用5 。 如果将分子信标应用于植物病毒的检测 ,凭借探针本身的高特异性和高灵敏度 ,可以避免冗长的 RTPCR 过程以及在 PCR 过程中易产生非特异性扩增要求的 PCR 模板制备过程。在定性检测病毒的同 时 ,该方法还可以通过对病毒 RNA 的含量进行测定 ,这对于 RTPCR 过程仅能进行半定量检测而言 , 同 样具有其优越性。 ( ) ( 基于此 ,我们根据常见的烟草花叶病毒 tobacco mosaic virus ,TMV 的遗传物质 ssRNA singlestranded RNA) 序列 ,设计了一种新型分子信标荧光探针 ,发展了一种直接检测病毒基因组 RNA 的新方法 ,对病 毒粒子和基因组 RNA 的提取都不需要严格的纯化 ,就可以用于植物病毒的检测。此外 ,还通过一系列 对照实验对此方法的准确性进行了验证。 2 　实验部分 2. 1 　仪器和试剂 ( ) ( HPG280B 光照培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ; F2500 荧光分光光度计 日本日立 )