分子生物学第五章 分子生物学研究法1教材编辑.ppt

酶及其浓度 　 　　　目前有２种Taq DNA聚合酶， 催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100uＬ时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度　 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris－HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTP应为50-200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸　 　　　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 　　　SDS主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 　　 蛋白酶K能水解蛋白质，特别是组蛋白，再用有机酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 　　　RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度　 　　　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，PCR反应中各dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度　 　　　Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR的基本原理 DNA模板 DNA引物 dNTP TaqDNA聚合酶 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA变性 形成2条单链 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR反应的全过程 ＰＣＲ反应包括DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。 待扩增DNA样品→94℃ 1min →变性(解链)→ 56℃ 1min →退火(引物结合靶DNA区段) → 72℃ 1至数分钟→延伸，合成新生DNA互补链。 以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 　　 　　　 PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 【开发史】　　这项技术的发明人是Kary Mullis。1983年，在一家生物高技术公司（Cetus）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法，即PCR。 　　 在1985年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。 　 Cetus给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年，Mulli