果汁饮料中过敏原α-乳白蛋白的检测研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

上海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学 博/硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 杨宪时 东海所 研究员 汪之和 上海海洋大学 教授 陶妍 上海海洋大学 教授 答辩地点 东海所 答辩日期 2014.5.30 果汁饮料中过敏原α-乳白蛋白的检测研究 摘要 牛乳含有丰富的蛋白质，深受人们的青睐,尤其对婴幼儿和老年人来说，是日 常生活中主要的营养物质来源。但同时，牛乳又是主要的过敏食物之一。调查表 明,牛乳过敏在人群中的发病率为 0.3-7.5%，其中一岁以下婴幼儿中的发病率达到 2-3%。牛乳中α-乳白蛋白属于溶菌酶家族，是导致牛乳过敏的主要过敏原蛋白之 一，据不完全统计，超过 51%的牛乳过敏是由α-乳白蛋白引起的。牛乳中α-乳白蛋 白与人乳中α-乳白蛋白的同源性约为 74%，另有 6%的氨基酸残基化学性质相似， 营养价值高、但致敏性强。牛乳常作为原料用于各种食品，最近几年，牛奶与果 汁搭配的果汁奶凭借其口感好、风味独特、营养价值高等优点而越来越风靡，然 而我国对于果汁饮料中的α-乳白蛋白检测基本处于空白阶段，所以开展针对果汁中 α-乳白蛋白的检测具有重要的理论和现实意义。 目前对于过敏原牛α-乳白蛋白检测的方法主要有免疫分析法，PCR 法以及仪 器分析法，在仪器分析法中高效液相色谱-串联质谱法（LC/MS/MS）具有抗背景 干扰和检测能力强、灵敏、准确、检测信息丰富等优点越来越广泛的被运用于α- 乳白蛋白的检测。本课题重点开展果汁饮料中牛α-乳白蛋白检测方法的研究。目前 国内外文献集中于奶粉、乳清蛋白粉中过敏原牛α-乳白蛋白的检测研究，对果汁饮 料中牛α-乳白蛋白的研究较少，且前处理较为繁琐，牛α-乳白蛋白回收率不尽理想。 本课题建立了基于肽水平的 LC/MS/MS 法检测分析果汁饮料中过敏原牛α-乳白蛋 白的方法，取得了一下的研究成果： 1、 筛选得到了牛α-乳白蛋白标签肽段 利用牛胰蛋白酶的特异性酶切将牛α-乳白蛋白分解成许多小肽段，根据肽段的 全扫描图谱与理论肽谱进行匹配挑选出了两条肽段，对这两段肽段进行灵敏度比 较 后 再 进 行 特 异 性 考 证 。 最 后 ， 对 应 牛 α- 乳 白 蛋 白 99-108 氨 基 酸 的 肽 段 VGINYWLAHK 因其在质谱 MRM 监测模式分析中具有较高灵敏度，并且是α-乳 白蛋白的保守序列具有较强的特异性可以作为牛α-乳白蛋白的标签肽段。 2、设计合成了检测牛α-乳白蛋白标签肽段的内标肽段 在牛α-乳白蛋白标签肽的基础上取代或者增加一个氨基酸设计合成了两段肽 I 段 VGINWWLAHK 和 VGINNYWLΑHK。将合成的两种肽段和牛α-乳白蛋白标签 肽的色谱行为和质谱行为进行了比较，发现肽段 VGINWWLAHK 与牛α-乳白蛋白 标签肽的色谱行为和质谱行为都比较接近，说明肽段 VGINWWLAHK 与牛α-乳白 蛋白标签肽具有相似的性质，可以作为本方法的内标肽。 3、获得了牛α-乳白蛋白标签肽的检测条件： 考察了不同的色谱柱、柱温、流速等色谱参数和质谱参数，最终得到的检测条 件为：使用Αgilent mRP-C18 柱（50×4.6mm，5μm）为分析柱分离目标物质，以含 0.1%甲酸的乙腈水溶液（98：2，v/v）为流动相作梯度洗脱，流速 0.6mL/min，柱 温 40℃，进样量：10μL，分析物在电喷雾正离子条件下，采用多离子监测模式， 用内标法定量。 4、设计合成了检测牛α-乳白蛋白标签肽段的内标物 设 计 合 成 了 与 牛 α- 乳 白 蛋 白 有 相 同 酶 切 位 点 的 内 标 物 肽 段 KILDKVGINWWLΑHKΑLCSE 使其具有与牛α-乳白蛋白相似的酶解效率，可以作 为本研究的内标物对整个方法处理过程进行跟踪考察以消除酶解效率和基质效应 等因素引起的误差。 5、建立了果汁饮料中过敏原牛α-乳白蛋白的检测方法 确立了方法的标准曲线、回收率、检出限和精密度等方法学参数。方法在 0.01～ 10μM 范围内线性关系良好，相关系数大于 0.999，在 0.05，0.1，0.2g/100mL 三个 添加水平时，果汁的平均回收率在 97.2%～103.4%之间，RSD 在 4.1%～6.4%之间 。 日内、日间精密度都低于 4.6%。本方法的检出限和定量限可达到 0.2mg/100m L、 0.6mg/100mL，能够满足果汁样品中低含量的牛α-乳白蛋白的检测需求。本文建立 的果汁饮料中过敏原牛α-乳白蛋白的检测方法，定性定量准确、快捷、抗干扰能力 强、灵敏度较高，方法准确性和重现好。与传统的液相色谱法相比，本研究不需 要牛α-乳白蛋白的纯化等繁杂步骤，操作简单，检测效率大大提高，为完善我国食 品