海参内脏中胶原降解蛋白酶的研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

3cm 左右万方数据集 美 大 学 硕 士 学 位 论 文 海 参 内 脏 中 胶 原 降 解 蛋 白 酶 的 研 究 麻 金 3cm 左右 万方数据 3cm 左右集 美 大 学 硕 士 学 位 论 文 海参内脏中胶原降解蛋白酶的研究 3cm 左右 万方数据 万方数据 学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人（签名）： 时 间： 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作 者（签名）： 导 师（签名）： 时 间： 海参内脏中胶原降解蛋白酶的研究 摘 要 我国是全球最重要的海参生产国，也是最大的海参消费市场。海参在离开海水、干露 时间过长或受到强烈刺激时，其体壁会溶化（自溶），该自溶问题对于随着北参南养技术 发展起来的南方海参更为突出，这给海参的保鲜、加工等环节带来诸多技术难题。研究表 明，胶原蛋白是海参体壁的主要构成成分，推测内源性酶对胶原蛋白的降解是其自溶的主 要原因。大量研究报道表明海参体内酶的种类丰富，但是与胶原降解相关自溶酶的研究报 道仍然很少。因此，研究海参体内胶原降解蛋白酶的酶学性质及其对胶原蛋白的分解尤为 重要。 海参在感受到刺激时，首先表现为排脏，导致内脏中内源性酶得到释放而参与到海参 体壁的溶解过程。因此，内脏中存在的蛋白酶与体壁溶解关系密切。所以，本论文选取富 含蛋白酶的海参内脏为实验对象，观察海参内脏溶解现象，并通过研究其中可降解明胶的 蛋白酶存在情况，初步探究海参内脏中可能的胶原蛋白酶。结果显示，内脏中含有多种明 胶降解蛋白酶，这些蛋白酶主要为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 利用明胶酶谱对海参内脏粗酶进行分析，发现 Ca2+对分子量为 33.2 kDa 的蛋白酶有激 活作用，且该酶活性又可被 EDTA 所抑制，表明其为金属蛋白酶。随后利用硫酸铵分级沉 淀结合 DEAE Sepharose 离子交换层析、Sephacryl S 200 凝胶层析、Phenyl Sepharose FF 疏 水层析及 Mini Q 离子交换层析，对该蛋白酶进行纯化，其纯化倍数及回收率分别为 190.0% 和 0.9%。利用金属蛋白酶荧光底物对该酶进行性质分析，发现其最适温度为 30 ℃，最适 pH 为 7.5，可以被金属蛋白酶抑制剂 EDTA、EGTA 完全抑制，亦可被 PMSF、Pefabloc SC 等丝氨酸蛋白酶抑制剂完全抑制。同时，通过硫酸铵盐析和 DEAE Cellulose 离子交换层析、 Sephacryl S 200 凝胶层析、Phenyl Sepharose HP 疏水层析及 Q Sepharose HP 离子交换层析 从海参内脏粗酶中获得分子量为 45 kDa 的明胶分解蛋白酶。利用明胶酶谱分析其酶学性 质，发现在 35~40 ℃，pH 为 8.0 左右具有较高的降解活性，丝氨酸蛋白酶及金属蛋白酶 抑制剂均可产生抑制作用，但金属离子不是其活性表现的必须物质，推测属于丝氨酸蛋白 酶家族。分别研究所得两种蛋白酶对天然海参胶原蛋白的作用情况，发现均可有效降解海 参体壁胶原，表明所纯蛋白酶为胶原蛋白酶，推测其可能参与海参的自溶过程。 鉴于海参自溶过程的快速性、与温度的相关性等特点，多种含量较低但活力很高的蛋 白酶共同参与降解胶原蛋白的可能性极大，尤其是排脏作用导致内脏的蛋白酶释放，使在 生理条件下完全隔离的内脏蛋白酶与海参体表直接接触，加快了体壁胶原蛋白的降解和自 溶。本文从海参内脏中分离纯化出两种可以降解胶原的蛋白酶，并详细研究了其酶学性质， 丰富了与海参自溶相关蛋白酶的信息，为海参保鲜、加工等过程中的品质保持及资源的高 I 效利用提供参考依据。 关键词: 海参内脏；金属蛋白酶；丝氨酸蛋白酶；分离纯化；性质分析 II Study on Proteinases Responsible for Collagen Degradation in the Viscera of Sea Cucumber (Stichopus Japonicus) Abstract Sea cucumber is highly exploited and demanded in the Chinese market. However, Sea cucumbers are easy to undergo autolysis (me