BS(法氏囊素)原核表达BS.docVIP

原核表达法氏囊素 一 目的 通过引物扩增或者直接合成BS基因，并将BS基因串联，插入质粒进行表达，表达产物经胰酶消化，超滤纯化目的三肽。 二 材料 1 载体 pUC18、pET20b（+） 2 酶 Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ、Bgl Ⅱ、T4 DNA连接酶。 3 工程菌 DH5α、BL21。 4 培养基 LB 5 抗生素 氨苄青霉素 6 诱导剂 IPTG 7 Ni -NTA His? Bind?树脂（试剂盒） 三 方法 引物设计PCR合成目的基因 引物设计 PCR合成目的基因 双酶切 回收目的片段 质粒选择 质粒双酶切 酶切质粒产物回收大片段 连接 酶切鉴定 转化克隆 Amp+挑单克隆 进行PCR鉴定 测序鉴定 转化表达 诱导表达 收获蛋白 纯化BS 胰酶消化 层析 合成目的基因 胰酶消化 成品 诱导表达条件筛选 2 引物合成/目的基因合成 按大肠杆菌惯用密码子选择赖氨酸-组氨酸-甘氨酸常用密码子5’ -GGT- CAC- AAA-3’(即BS基因) 2.1 引物合成 2.1.1 BS合成引物设计(将5个BS串联): p1: 5’-caagcttgggaagatcttctttgtgacc-3 p2:5’-cgcggatccgggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaagaagatcttcccaagcttgg-3 酶切位点：Bam H Ⅰ（ggatcc），Bgl Ⅱ（agatct），Hind Ⅲ（aagctt） 2.1. pUC18-bs检测引物：与BS合成上游引物配对 p3 5’-tttacactttatgcttccggctcgtatgtt pET20b(+)-bs8检测引物：与BS合成上游引物配对 p4 5’-taatacgactcactatagggagaccacaacgg 2.1. pUC18-bs1约180bp； pUC18-bs2约234bp； pUC18-bs4约342bp； pUC18-bs8约558bp； pET20b（+）-bs8约615bp。 2.2 直接合成目的基因 2.2.1 购买合成基因片段 5’-cgcggatccgggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaga 3’-gcgcctaggcccagtgtttccagtgtttccagtgtttccagtgtttccagtgtttct tcttcccaagcttgg-3 agaagggttcgaacc-5 2.2.2 检测引物设计 p1: 5’-caagcttgggaagatcttctttgtgacc pUC18-bs检测引物：与P1引物配对 p2 5’-tttacactttatgcttccggctcgtatgtt pET20b(+)-bs8检测引物：与P1引物配对 p3 5’-taatacgactcactatagggagaccacaacgg 3 载体构建 3.1 构建pUC18-bs载体 3.1.1构建pUC18-bs1 将pUC18用Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ进行双酶切，回收大片段；将目的基因片段用Hind Ⅲ、Bam H Ⅰ进行双酶切，回收大片段。酶切后的大片段产物进行连接，构建pUC18-bs1。将连接后载体转化至DH5α，在Amp+LB平板上挑取单克隆，同时进行酶切鉴定及PCR鉴定，PCR产物应为180bp。 3.1.2 构建pUC18-bs2 用BglⅡ、Bam HⅠ双酶切目的基因，回收大片段；用BglⅡ酶切pUC18-bs1，回收大片段，将酶切回收后的大片段进行连接，构建pUC18-bs2。将连接后载体转化至DH5α，在Amp+LB平板上挑取单克隆，同时进行酶切鉴定及PCR鉴定，PCR产物应为234bp。 3.1.3 按3.1.2方法分别构建pUC18-bs4（PCR产物应为342bp）、 pUC18-bs8（PCR产物应为558bp）等。 构建方法见下图。 T4连接酶 T4连接酶 BglⅡ Bam HⅠ T4连接酶 Bam HⅠ Bgl Ⅱ Bgl Ⅱ Bgl Ⅱ T4连接酶 Bam HⅠ Bgl Ⅱ Bgl Ⅱ T4连接酶 Bam HⅠ、Hind Ⅲ Bam HⅠ Hind Ⅲ Bam HⅠ Hind Ⅲ 3.1.4 pUC18-bs8载体表达序列 串联BS 串联BS 起始密码子 终止密码子 启动子 上游引物 下游引物 3.2 pET20b（+）-bs载体构建 将构建好的pUC18-bs8用Bam HⅠ、Hind Ⅲ进行双酶切，回收目的基因片段；用Bam HⅠ、Hind Ⅲ双酶切pET20b（+），并回收大片段；将两回收片段进行连接，构建成pET20b（+）-bs8载体。将连接后载体转化至BL21，在Amp+LB平板上挑