胰岛素干预对白消安致小鼠生精细胞耗损恢复效果探究.docxVIP

胰岛素干预对白消安致小鼠生精细胞耗损恢复效果探究 【摘要】目的：研究胰岛素对化疗致不育小鼠生 精细胞的恢复效果，明确胰岛素促进在体精原干细胞再生的 效果。方法：4周龄雄性C57小鼠腹腔注射白消安(30mg/kg), 注射后4周按60?g/kg体重剂量腹腔注射胰岛素进行干预， 每天一次连续注射7天。在干预后第4周收集睾丸，检测睾 丸重量、通过HE染色检测生精小管中生殖细胞恢复情况； 通过RT-PCR检测GDNF和SCF基因表达评价胰岛素注射对小 鼠精原干细胞微环境的影响。结果：在胰岛素干预后第4周, 睾丸重量明显得到恢复，生精小管中上皮细胞数量明显得到 恢复，精原干细胞微环境中再生因子GDNF和分化因子SCF 表达水平稳定。结论：胰岛素干预可以促进化疗致精原干细 胞耗竭小鼠睾丸中生精细胞数量明显恢复，且维持了精原干 细胞微环境中再生分化调控的平衡关系。 【关键词】胰岛素；化疗；生精细胞；精原干细胞微环 境 【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】 1004—7484 (2013) 11—0018—02 男性不育症的治疗一直是困扰许多家庭和泌尿男科医 生的疑难问题。随着生殖医学、体外受精和显微操作助孕技 术的发展，特别是卵胞质内单精子注射(Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI )和显微外科技术的逐渐普及，男 性不育症的治疗逐渐由传统的药物治疗转换到辅助生殖领 域。但是新近的研究不断发现一些非梗阻性无精子症患者如 青春期前的淋巴瘤或白血病等患者接受全身大剂量化疗后 失去生育能力者，由于睾丸和附睾内没有单倍体生殖细胞， 使ICSI技术的应用受到限制。已有研究表明，化疗药物白 消安是一种烷化剂，能够杀死体内精原干细胞，从而使得精 子发生耗竭。40mg/kg体重白消安单次腹腔注射4周后小鼠 睾丸内几乎所有精原干细胞都被杀死，精子发生中断，造成 不育［1, 2］。通过治疗恢复放化疗患者体内精子发生成为治 疗该类不育的关键。本研究对化疗不育小鼠腹腔注射胰岛 素，探索外源胰岛素对化疗后不育小鼠睾丸内生精细胞恢复 效果。 1材料与方法 1.1实验动物：4周龄C57雄性小鼠，购自宁夏医科大 学实验动物中心，在恒温条件下(20-250饲养，光照周期 为12 h有光，12 h无光，自由采食饮水。 1.2白消安处理：4周龄C57雄性小鼠，分别按40mg/kg 体重和30mg/kg体重两种剂量腹腔单次注射白消安，制备精 原干细胞高剂量白消安和低剂量白消安损伤模型［2, 3］。注 射时首先将白消安溶解于二甲基亚枫(DMSO)中，然后用等 体积水稀释后进行腹腔注射，对照组小鼠腹腔注射相应剂量 DMSO与水的混合物。 1.3胰岛素干预：白消安处理后4周，低剂量白消安损 伤模型组小鼠进行脈岛素干预处理，既按照60 u g/kg体重 剂量腹腔注射胰岛素，每天注射1次，连续注射7天。高剂 量白消安损伤模型组小鼠不进行胰岛素干预。 1.4切片HE染色：胰岛素干预后4周，将对照组、白消 安处理组以及胰岛素干预组小鼠脱臼处死，消毒，取出一侧 睾丸，立即投入boin固定液（75ml苦味酸，25ml甲醛溶液, 5ml冰醋酸）中，固定48ho然后脱水，透明，浸蜡，包埋 和切片。石蜡切片脱蜡，染色，脱水，最后中性树脂封片。 在光学显微镜下检查各组小鼠睾丸组织睾丸精细小管内生 殖细胞的变化。另一侧睾丸用于RNA提取。 1. 5 RT-PCR检测基因表达情况：胰岛素干预后4周，收 集对照组、白消安处理组以及胰岛素干预组一侧小鼠睾丸， 提取总RNA,纯化（除去RNA中DNA）,反转录。反转录引物 设计及合成是根据GenBank中小鼠B-actin、GDNF及SCF 的cDNA序列，采用0ligo 6. 0软件设计引物，由上海生工 生物工程技术服务有限公司北京合成部合成（表1）。反转录 产物cDNA PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，采用mage-Pro Plus 6. 0 （IPP）软件对泳带进行灰度分析。 1. 6统计学方法：各组间精原细胞增殖系数以及GDNF和 SCF基因表达水平采用SPSS软件进行单因素方差分析 (one-way AN0VA)o P0.05)。胰岛素干预后4周，胰岛素对 生精小管中支持细胞表达的精原干细胞微环境再生因子 GDNF和分化因子SCF基因表达水平都没有影响。 图 3?胰岛素干预后4周对照组、低剂量白消安损伤模型组以及 胰岛素干预组小鼠睾丸中GDNF和SCF mRNA表达情 况.A. RT-PCR凝胶图.B. RT-PCR凝胶图灰度分析，SCF和GDNF 在对照组、低剂量白消安损伤模型组以及胰岛素干预组3个 组间表达差异不显著.n=6. 3讨论 本研究发现，胰岛素干预可以使得低剂量白消安造成精 原干细胞损伤