海参溶菌酶基因的克隆及结构分析-发酵工程专业论文.docxVIP

缩略涮表缩略词表 缩略涮表 缩略词表 《 Amp ampicilin 氨苄青霉素 bp base pair 碱基对 Blast basic local alignment search tool 基本局域联配搜索工具 CDNA complementary DNA 互补DNA DEPC diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核苷酸 EB ethidium bromide 溴化乙锭 IPTG isopropylthio．p—D．galactoside 异丙基硫代一p-D一半乳糖苷 kb kilobase 千碱基对 NCBI National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心 ORF open reading frame 开放阅读框架 PCR polymerase chain reaction 聚合链式反应 RACE rapid amplification cDNA end cDNA术端快速扩增 lU’_PCR reverse transcription．polymerase chain reaction 逆转录聚合链式反应 RNA ribonucleic acid 核糖核苷酸 X-gal 5-bromo-4一chloro．3．indolyl．p．D．galactoside 5．溴。4．氯．3．吲哚-p—D一半乳糖 UTR untranslated region 不翻译区 ’ ◆ 摘 摘 要 摘 要 溶菌酶(1ysozyme)二7,．称胞壁质酶(muramidase)，是天然非特异性免疫物质，具有强力 杀菌作用，广泛存在于各种植物、动物和微生物中。 本论文运用了一种以PCR为基础的快速克隆全长eDNA的方法。该方法利用简并 RT-PCR结合eDNA末端快速扩增(RACE)法，可直接获得目的基因的全长序列，避免了复 杂的构建、筛选eDNA文库的过程。根据以海星、海胆等棘皮动物溶菌酶基因、类溶菌 酶基因及其他多种无脊椎动物的溶菌酶保守序列为参考，设计简并引物，通过RT-PCR 技术从海参中获得-j222bp的cDNA片段。根据已知的片段序列设计引物，利用3’RACE 和5’RACE技术扩增未知片断，通过测序、拼接获得海参溶菌酶基因cDNA全长713bp， 该基因在GenBank中登录号为EF036468。序列分析表明，该基因cDNA包含一完整丌放 阅读框，编码145个氨基酸，在3’端的非编码区中有真核基因polyA力ll尾信号序列 AATAAA的出现。该基因含有246bpl拘5’非编码区和29bp的3’非编码区。推测的溶菌酶分 子量为13．8kDa，理论等电点为7．63。序列比对发现与海参溶菌酶基因的推测氨基酸序列 相似性较高的26条全是其它物种的溶菌酶序列，而且与欧洲海星(Asterias rubens)的相似 性最高，可达72％。以海参基因组DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，得到海参溶菌 酶基因的全长DNA序列，与海参溶菌酶基因cDNA序列比较发现，海参溶菌酶基因的全 长DNA序列有一个长度为1139bp的内含子。 以海参为材料提取基因组DNA，以DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，扩增 产物经克隆测序、酶切位点分析后用作Southern杂交的探针。用限制性内切酶BamH I、 EcoR I和Xho I消化基因组DNA，经0．8％琼脂糖凝胶电泳后，利用向上毛细血管转移 法将DNA转移到带币电荷的尼龙膜上。地高辛标记探针，在杂交箱中杂交。BamH I和 ▲ Xho I酶切产物出现了一条杂交带，表明溶菌酶基因在海参基因组中是单拷贝。 ◆ 以海参为材料提取总RNA，以总RNA为模板进行特异引物的RT-PCR扩增，扩增 产物经克隆测序后用