胱硫醚β合成酶在酒精性肝病发病机理中的作用的实验研究-内科学专业论文.docxVIP

目 目 录 中文摘要 ．1 英文摘要 ．4 研究论文胱硫醚13合成酶在酒精性肝病发病机理中的作用的实验研究 前言日U吾 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．8一 材料与方法 ’8 结果 ．．12 附图 14 附表 26 讨论 ．．29 结论 ．．34 参考文献 ．34 综述高同型半胱氨酸血症与酒精性肝病 ．37 致谢 ．． ．．．56 个人简历 ．．57 中文摘要胱硫醚13合成酶在酒精性肝病发病机理中 中文摘要 胱硫醚13合成酶在酒精性肝病发病机理中 的作用的实验研究 摘 要 目的：酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是长期大量饮酒所 致的肝脏损害性病变，其病理改变包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、 酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化。关于ALD的发病机理目前尚不清楚， 近年来有人提出以氧化应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”假说，“第 一次打击使脂类沉积在肝细胞，导致脂肪肝，“第二次打击’’涉及内毒 素、细胞因子参与的氧化应激和脂质过氧化。内质网(endoplasmic reticulum，ER)作为细胞中蛋白成熟的场所，可以很敏感的感受细胞内外 环境的变化。当内质网内环境改变，细胞就会激活信号应对这些改变，并 且重新恢复折叠蛋白的环境，内质网的这种改变就是内质网应激 (endoplasmic reticulum stress，ESR)，而对这种应激作出的反应就是非折 叠蛋白反应(Unfolded Protein Response，切)R)。内质网应激是内质网内 未折叠或错误折叠蛋白积聚所致，适宜的应激有利于细胞内环境的恢复， 然而严重而持久的内质网应激将导致细胞凋亡。肝细胞具有高度发达的内 质网，是对内质网应激最敏感的细胞之一，目前的研究也表明在细胞和动 物模型中，内质网应激参与了酒精性肝病的发病过程。葡萄糖调节蛋白．78 (glucose．regulated protein，GRP78)，又称免疫球蛋白重链结合蛋白，与 热休克蛋白70具有同源性，是存在于内质网上最多的伴侣蛋白，是内质 网应激反应的标志性分子，并且具有保护细胞、对抗细胞凋亡的作用。胱 硫醚D合成酶(cystathionine beta．synthase，CBS)，为吡哆醛磷酸依赖性酶， 主要在肝脏合成，是同型半胱氨酸(homocysteine，Hey)代谢过程中的 关键酶，其活性的降低是高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia, HHcy)发生的主要诱因之一。同型半胱氨酸(Hey)在CBS的作用下，以维 生素B6为辅助因子，与丝氨酸结合形成胱硫醚，进一步形成半胱氨酸和 a-酮丁酸。Hhcy使内质网内错误折叠的蛋白增加，而诱发内质网应激， 激活非折叠蛋白反应。本研究旨在应用酒精灌胃建立大鼠ALD模型，用 比色法测定CBS活性，免疫组织化学染色及逆转录聚合酶链反应(reverse 中文摘要transcription．polymerase 中文摘要 transcription．polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法观察GRP-78蛋白 及GRP-78 mRNA的表达情况，探讨CBS在ALD发病过程的表达及意义， 为有效防治ALD提供新的思路。 方法：选用雄性健康清洁级Wister大鼠50只，体重200士209，正常 饲养1周后随机分出10只为正常对照组，其余动物采用逐渐增加酒精浓 度(浓度30％一60％，乙醇5．99·l嘻1．d。1)的方法酒精灌胃，分别于4周、8 周、12周和16周末随机处死动物10只、9只、8只和8只，留取血清及 肝组织标本；检测血清√蝴、AST、TG、TC、HDL、LDL、VLDL、Hcy 等生化指标；取部分肝组织立即冰冻切片行苏丹Ⅳ染色，观察肝细胞脂变 性情况；另取肝组织固定于4％中性福尔马林溶液，石蜡包埋，51Jxn切片 行苏木精．伊红(hematoxylin．eosin，HE)染色观察肝组织的普通病理改变， 天狼红染色观察肝组织纤维化程度：并用石蜡切片进行免疫组织化学染 色，观察肝组织GRP．78蛋白表达情况；余肝组织经液氮速冻后置于．80℃ 冰箱，用RT-PCR观察大鼠肝组织GRP．78 mRNA的表达。 结果： 1血清肝功能指标的变化：随着造模时间的延长，血清—岍和AST 水平逐渐升高，CHE逐渐降低，与正常对照组比较PO．05或P0．01。 2血清血脂指标的变化：随着造模时间的延长，血清TG、TC、LDL、 VLDL的水平逐渐升高，HDL水平逐渐降低，与正常对照组比较PO．05 或P0．01。 3肝组织病理学改变