中药化学-第七单元--色谱操作.pptVIP

第八单元 色谱操作 色谱分离条件的选择 吸附色谱的操作技术 操作形式： 吸附薄层色谱 吸附柱色谱 柱色谱法 经典的柱色谱法是将作为固定相的吸附剂装在一根玻管柱中(柱长一般从几十厘米到上百厘米不等)，从管顶加入样品溶液，再从管顶加人流动相。使流动相从上往下流过而使各种成分分离并依次流出色谱柱的过程称为洗脱。在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液并进行检查，每一份洗脱液从几毫升到几十毫升甚至几百毫升不等。整个分离过程需几小时甚至几天才能完成。经典柱色谱法主要用于分离和精制较大量的样品，通常适用于几十毫克到几十克样品的分离。 近几十年来飞速发展的高效液相色谱法采用远小于经典色谱法的色谱柱(柱长5—30cm，柱内径0.2—4.0 cm)，较细的固定相(粒径5～10μm)，用高压泵输送流动相，具有分离性能好、分析速度快、流出组分容易收集、可以在线检测和仪器化等经典色谱法所无法比拟的优点。 色谱柱的选择 色谱柱的内径与柱长的比例一般在1：10～1：20(30)之间。 有时为了获得好的分离效果，可采用细长的色谱柱； 有时为了从溶液中吸去某种成分、滤去不溶物以及在利用活性炭脱色时为滤去细微的活性炭颗粒或若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围窄，则可采用短柱(1：5)，这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。 有的色谱柱下端有活塞,有的有塞板。 装柱 A．干法装柱。直接用小漏斗将吸附剂均匀装入柱内的方法。 B．湿法装柱。将吸附剂装入盛有洗脱液的柱内，或将吸附剂与洗脱液混合成混悬液再装入柱中。 C．操作要点 装柱前柱底要垫一层脱脂棉、玻璃纤维或塞板以防吸附剂外漏。干法装柱时要用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使吸附剂装填连续均匀、紧密，然后用洗脱剂洗脱并保持一定液面；湿法装柱时注意打开下端活塞，洗脱剂应始终保持一定的液面高度，为了增强分离效果，提高分离速度，可在柱面覆盖一层处理干净的均匀的细沙（石英沙、粗硅胶）。 根据所采用吸附剂的不同，装柱方法略有不同： 氧化铝 一般先准确量取一定体积的溶剂(Vo)，将色谱柱的活塞稍打开，将溶剂滴人接受器中，同时将氧化铝慢慢地加入，保持边沉降边添加的状态，直至加完。氧化铝加入速度不宜太快，否则将带人空气泡。必要时可以在色谱管外轻轻敲打振动，使氧化铝均匀下降，并有助于赶走气泡。当采用活性较高的氧化铝进行色谱时，更应注意。待氧化铝加完后，仍使溶剂流动一定时间，然后将氧化铝上面的溶剂全部滴人接受器，准确量取接受器内的溶剂量(V1)。从Vo—V1之差，就可以知道氧化铝内包含的溶剂体积。这样在色谱过程中，就可以掌握大致在什么时候开始收集流出组分；当变换溶剂的时候，就可以知道新换溶剂大致在哪一流分开始。 硅胶 由于硅胶多为多孔性物质， 一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾人层析柱中，最好一次倾人，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果。另亦可采用干法装柱，将所需硅胶一次倾人柱中，然后蹾紧至硅胶高度不改变为止。 当采用分配层析时，应先将预先选定的固定相溶剂如水、缓冲液或极性溶剂加入硅胶中，一般比例为1：0.5—1较为适中，搅拌混合均匀，倾人预先选定的移动相溶剂中并激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡．层析管中事先放人用固定相溶剂剧裂振摇饱和后的移动相，将上述吸着固定相的硅胶按湿法装柱，不断轻敲管壁，使均匀紧密．另外亦可采用加硅胶于固定相饱和的移动相中，按湿法装柱，然后用固定相饱和的流动相通过硅胶柱，使达到层析时稳定的平衡条件． 活性炭 因活性炭在水中的吸附力最强，一般在水中装柱。色谱柱内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部，并除去玻璃纤维中的气泡。活性炭以蒸馏水浸泡1h左右，不断搅拌除去气泡。然后倒人柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。 粉末活性炭因流速太慢，需与硅藻土(1：1)混合后，再用蒸馏水调成糊状装柱。并且待样品上柱后，在色谱管顶端连一有自动控制的加压泵或在色谱管下端连一减压泵进行色谱。 聚酰胺 预处理： 取聚酰胺粉以90％一95％乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入色谱柱中。用3—4倍体积的90％一95％乙醇洗涤，洗至洗液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用2—2.5倍体积，质量浓度为5％的NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2—2.5倍体积的10％醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，备用。 装柱： 若用含水溶剂系统洗脱，常以水装柱，方法同活性炭的装柱。 若用非极性溶剂系统洗脱时