第三章、第四章--外植体的接种和培养.pptVIP

第一节 培养基的成分 第二节 培养基的配制 第三节 常用培养基的配方;一、准备工作 二、母液的配制与保存 三、培养基的制备 四、培养基的灭菌;第三节 常用培养基的配方及特点;第三章 外植体的选择与消毒;一、植物基因型 二、外植体部位 三、取材季节 四、外植体的生理状态和发育年龄 五、外植体大小;草本植株木本植物； 双子叶植物单子叶植物； 木本植物中，猕猴桃较易再生植株；而干果 类、松树、柏树等就比较困难； 植物基因型不同，组培再生途径也不同 ;生长健壮无病虫害的植株； 同一植物不同部位之间的再生能力差别较大； 茎尖； 茎段、叶片及其它 ;植物生长的最适时期：生长开始的季节 如苹果芽、百合鳞片; 越嫩，年限越短的组织具有越高的形态发 生能力，如生菜的心叶。;胚胎培养或脱毒，外植体宜小 快速繁殖，外植体宜大 一般外植体：0.5～1.0cm 叶片、花瓣等约为0.5cm2 茎段则长约 0.5-1cm 茎尖分生组织约0.2～0.3mm大小等。;第二节 外植体的消毒方法;一、常用消毒剂及其效果;1、乙醇(70% -75%) 特点：穿透力和杀菌力强，浸润和灭菌； 不能彻底灭菌； 2、升汞(0.1%-0.2%) 特点：灭菌效果好； 容易残留； 3、次氯酸钠(2-10%) 特点：灭菌效果较好，无残留；;4、漂白粉(10% -20%) 特点：低毒有效 易吸潮失效，随配随用； 5、双氧水(6%-12%) 特点：效果较好，易除去； 6、新洁尔灭(1→200) 特点：广谱表面活性灭菌剂，低毒有效；;二、外植体的消毒原则;1、外植体灭菌的一般步骤 预处理 表面浸润：75%酒精 消毒液浸泡 无菌水冲洗;1）茎尖、茎段及叶片等的消毒 2）果实及种子的消毒 3）花药的消毒（整个花蕾或幼穗） 4）根及地下部器官的消毒;1） 茎尖、茎段及叶片等的消毒 自来水冲洗→75%表面浸润后无菌水冲1-2次 →消毒 液采用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min→无菌水 冲洗3次及以上； 2）果实及种子的消毒 果实：自来水冲洗10～20分钟→酒精迅速漂洗→用2%次氯酸钠溶液浸 10min后→用无菌水冲洗2～3次； 种子：10%次氯酸钠浸泡 20～30min甚至几小时，难以消毒的可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒； 胚或胚乳培养：去掉种皮→4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min→无菌水冲洗；;3）花药的消毒（整个花蕾或幼穗） 70%酒精浸泡数秒→无菌水冲洗2～3次→漂白粉清液 中浸泡10分钟→经无菌水冲洗2～3次。 4）根及地下部器官的消毒 自来水冲洗→软毛刷刷洗（去掉损伤及污染严重部 位）→吸水纸吸干→酒精漂洗→0.1%～0.2%升汞浸5～ 10min或2%次氯酸钠溶液浸10～15min→无菌水冲洗3次→ 无菌滤纸吸干。 ;第四章 外植体的接种与培养;一、接种室的消毒 二、外植体的接种;1、在接种前30分钟用75%乙醇喷雾降尘埃和消毒； 2、在接种前20min，打开紫外灯； 3、洗净双手，换好专用实验服和拖鞋等； 4、上工作台，用酒精棉球擦拭双手及擦拭工作台面； 5、用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿灼烧灭菌； 6、接种时，双手不能离开工作台，不能说话、走动咳嗽等； 7、接种完毕后要清理干净工作台。;1、植物材料的消毒 2、外植体的切割 切割：速度快 分离：较大材料，肉眼观察 较小材料，双筒解剖镜下 接种：防止交叉污染的发生，如无菌滤纸、刀和镊子; 左手拿试管或三角瓶，用右手轻轻取下包纸，使瓶口靠近酒精灯火焰，并将瓶口在火焰上方转动，使瓶口里外灼烧数秒钟（若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面）。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在培养基上，茎尖、茎段要正放，以放1—3块为宜。包扎瓶口并做好标记。;第二节 外植体的培养方法;第三节 培养条件;一、污染的原因及预防措施 二、外植体的褐变及防治措施 三、培养物的玻璃化及预防措施 ; ;; ; ;1、褐变 2、褐变的原因 基因型 外植体的生理状态 培养基的成分 无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。; 选择适宜的外植体 最佳培养基及培养条件 连续转移 加抗氧化剂 活性炭 ; ; ; ; ; ;第六节 植物组织培养中常用的灭菌方法;一、灭菌;二、常用灭菌方法;原理：在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 保证高压：1)注