海洋弧菌复苏促进因子家族糖蛋白酶的研究-微生物学专业论文.docxVIP

IIII IIII I I TI I l l TI IT Ifll IIl Y1 927003 海洋弧茵复苏促进因子家族糖蛋白酶的研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字 .，，Jl . ， 独创声 独创声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 《洼!翅逡查基丝煎墓挂别直明煎：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 ．用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：衩日B彩 签字日期：p11年工月，J日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：救BB幂 导师签字： 谬预 签字日期：枷11年j月，旧 签字日期：训年拍11日 l l 海洋弧菌复苏促进因子家族糖蛋白酶的研究摘要 海洋弧菌复苏促进因子家族糖蛋白酶的研究 摘要 副溶血弧菌(Fibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Fibrio harveyi)广 泛分布于江湖河口及海洋环境，是引起水产动物疾病的条件性致病菌，副溶血 弧菌也是引起人食物中毒的重要病原菌。副溶血弧菌和哈维氏弧菌在不良环境 形成活的非可培养(VBNC)状态，条件适宜时复苏为可培养形式，引起动物 疾病，但有关细菌复苏的机制仍不清楚。藤黄微球菌细胞复苏促进因子 (Resuscitation-promoting factor,Rpf)的发现是研究休眠菌复苏机制的一个重大突 破，微量的Rpf能有效促进休眠微球菌的复苏以及生活状态细菌的增殖。有关弧 菌细胞复苏促进因子家族蛋白的结构与功能研究报道较少，本文对副溶血弧菌和 哈维氏弧菌的Rpf家族的糖蛋白酶(glycoprotease，Gcp)基因进行克隆、表达， 并构建哈维氏弧菌gcp基因突变株，对表达Gcp生物学功能及突变株性质进行 研究，为进一步探索海洋弧菌VBNC状态的形成和复苏机制奠定基础。 从副溶血弧菌、哈维氏弧菌基因组中克隆的gcp基因由702 bp组成，编码 233个氨基酸残基的蛋白质，都不含有明显的信号肽和跨膜蛋白结构域。副溶血 弧菌8621．4的Gcp与其他副溶血弧菌菌株、哈维氏弧菌、溶珊瑚弧菌、拟态弧 菌、费氏弧菌、杀鲑弧菌等的糖蛋白酶的氨基酸序列相似性为67％一100％，与 变形杆菌和沙门氏菌复苏促进因子的相似性分别为55％和57％，与耶尔森氏菌 的M22肽酶YeaZ的相似性为55％。哈维氏弧菌SF．1的Gcp序列与其他哈维氏 弧菌菌株、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶珊瑚弧菌、霍乱弧菌、梅氏 弧菌和灿烂弧菌等糖蛋白酶的氨基酸序列相似性分别为69％一98％，与大肠杆 菌糖蛋白酶的序列相似性为58％一59％。 将副溶血弧菌8621．4和哈维氏弧菌SF．1的gcp基因克隆于原核表达载体， 在大肠杆菌中表达，采用Ni亲和层析柱纯化的Gcp为单一的蛋白带。利用纯化 的副溶血弧菌8621．4表达Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体， Westem．blotting方法检测发现『F常生长的副溶血弧菌8621．4和哈维氏弧菌SF．1 胞内表达Gcp蛋白，在培养上清中检测不到表达的Gcp，分子量约为27 kDa， 与已报道其他细菌的Rpf分子量相近；VBNC状态诱导过程中(低温寡营养)的 副溶血弧菌8621．4和哈维氏弧菌SF．】菌体也能特异性表达该蛋白，而在VBNC 状态的副溶血弧菌菌体中检测到2条特异表达蛋白带，其中一条蛋白的分子量约 状态的副溶血弧菌菌体中检测到2条特异表达蛋白带，其中一条蛋白的分子量约 为27 kDa，另一条蛋白的分子量约为54 kDa，推测其为Gep蛋白的二聚体。研 究发现哈维氏弧菌sF一1表达的Gcp蛋白对正常生活状态下SF．1的促生长作用非 常显著(OD590，p0．01)，通过同源重组构建gcp基因突变株，发现正常生活状 态的突变株MUTSF—l比野生株的生长能力强(ODs90，pO．01)，但添加Gcp蛋 白的突变株和野生株的