课件：角化细胞培养研究进展.pptx

角化细胞(KC)培养研究进展提纲KC来源及分化过程KC的作用KC培养方法 滋养层细胞培养无滋养层细胞培养影响KC培养的的因素 霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+)一、KC来源及分化过程KC来源及分化过程1.皮肤结构和KC来源皮肤主要由表皮和真皮组成，中间由基底膜隔开；表皮由上至下分别为角质层、颗粒层、棘层和基底层；KC主要来源于基底层。KC来源及分化过程2.KC分化过程凋亡KC终末分化KC桥粒和角化包膜形成10-14d定向祖细胞表皮干细胞干细胞含量较少，通常处于静息状态，分裂缓慢，短时间获取大量干细胞难度大；而定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点。二、KC的作用KC的抗菌作用1. KC通过PRR识别病原体Kollisch等(2005)用RT-PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型。PGN、poly (I:C)和flagelli可分别与KC的TLR2、TLR3和TLR5结合，从不同程度刺激KC分泌IL-8说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式(PAMP)，分泌IL-8等物质清除病原体。KC的抗菌作用2. KC分泌AMP杀灭病原体KC在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的AMP。阳离子抗菌肽主要有LL-37、防御素和S100蛋白家族(Harder and Schroder, 2005)。Glaser等(2005)用抗菌测试试验发现抗菌肽S100A7可特异性的杀死大肠杆菌。ONG等(2005)研究发现LL-37能有效杀灭葡萄球菌。三、KC的培养方法KC培养最早始于1967年(Briggaman等，1967) ，随后人们陆续培养出鼠(Marvin等，1971)、兔(Liu等，1978)和狗(Wilkinson等，1987)等的KC。使用的培养方法包括滋养层培养法和无滋养层培养法。滋养层细胞培养1.以3T3细胞作为滋养层 1975年，Rheinwald等首次成功地在体外连续培养人正常KC。 他们把射线灭活的鼠3T3细胞作为滋养层，将胰蛋白酶消化后的单个KC接种于其上，发现KC能明显抑制3T3细胞，且自身生长良好，并将3T3滋养层细胞不断推至培养皿边缘。图中红色为KC，蓝色为3T3细胞滋养层细胞培养1.以3T3细胞作为滋养层5d18dAlain等(1986)用3T3滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊KC。滋养层细胞培养2.以成纤维细胞作为滋养层Alain等(1989)首先介绍了用自体成纤维细胞代替3T3细胞作为滋养层，成功培养了人头皮毛囊KC。6d真皮成纤维细胞 丝裂霉素C或射线有丝分裂后细胞3weeks接种KC成纤维细胞滋养层滋养层细胞培养优点：细胞接种密度低、增殖速度较快、细胞生长稳定；而且灭活的3T3细胞自身无生长能力，有利于接种的KC生长增殖。弊端：一反面可能会造成KC和3T3细胞的混合污染，另一方面存在着将3T3细胞DNA遗传信息整合入增殖的KC内的危险。无滋养层细胞培养Wilkinson等(1987)率先用无滋养层方法成功分离培养了狗KC。皮肤组织分离酶4℃孵育18h表皮20℃孵育45min吸管吹吸KC特定培养基培养、传代无滋养层细胞培养Hager等(1999)用无滋养层方法成功分离培养了小鼠KC，并将其传至第19代，但只有前10代细胞具有分化能力。真皮胶原酶纱布过滤、离心混合细胞HCM成纤维细胞EMEM.06成纤维细胞条件培养基EMEM.06(1:1)KC培养基无滋养层细胞培养Caldelari等(2000)在Wilkinson方法基础上成功分离培养了17.5d小鼠胚胎KC，并在传至第61代依然保持分化活性。17.5d小鼠胚胎皮肤分离酶defined keratinocyte-SFM表皮剪碎胰酶消化KC提高Ca2+浓度后，Keratin和E-cadherin表达呈阳性，且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络，细胞间形成稳定的连接结构，说明细胞仍保持分化活力。defined keratinocyte-SFM培养、传代无滋养层细胞培养有学者认为无滋养层培养的细胞缺少分化标记物(中间丝蛋白、张力原纤维和桥粒)的表达(Prignano等，1999)；小鼠KC在培养30代后会出现非整倍型染色体。四、影响KC培养的因素人为因素接种密度、传代时间培养基无血清培养基、霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+) 影响KC培养的因素1.霍乱毒素(CT)CT是分子量为8400D的蛋白质，由A和B两个亚基组成。B亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面，A亚基可激活腺苷酸环化酶。Green(1978)发现浓度为10-11-10-9M的CT均可有效促进细胞生长。影响KC培养的因素1.霍乱毒素(CT)向培养基中加入浓度范围为10-14-10-8M的CT后6h，可成百倍的提高胞内cAMP浓度。②①③说