猪CD127流式单克隆抗体的研制.pdfVIP

南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2018，49（3）：572-579 ·572 · 南 方 农 业 学 报 49卷 ISSN2095-1191；CODENNNXAAB DO ：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.03.24 猪CD127流式单克隆抗体的研制 1 2 1 1 1 1 1 赵久刚 ，杨溢欢 ，潘红梅 ，朱 丹 ，龙 熙，涂 志，张凤鸣， 1 1 1* 郭宗义，陈四清，蓝 静 1 （重庆市畜牧科学院/农业部养猪科学重点实验室/重庆市养猪工程中心，重庆 402460 ； 2 西南大学 荣昌校区，重庆 402460 ） 摘要：【目的】研制出猪CD127（调节因子IL-7受体α链）流式单克隆抗体，为研究分析猪淋巴细胞亚群，尤其是猪 Treg细胞亚群提供流式细胞分析抗体，也为进一步探究猪抗病性状与免疫机制间的关系打下基础。【方法】克隆猪 CD127基因片段，通过原核载体诱导表达出相应的融合蛋白，以纯化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，然后取其脾细胞 与SP2/0骨髓瘤细胞融合，综合ELISA和流式细胞仪检测筛选出亚克隆抗体，并采用Western blotting验证所得亚克隆 抗体能否与猪淋巴细胞上的CD127特异性结合。【结果】猪CD127基因cDNA全长1999 bp ，第49~ 1428 bp为开放阅读 框（ORF ），编码459个氨基酸，其中前21位氨基酸为信号肽，成熟肽N端第1~219位氨基酸为胞外蛋白，第220~242位氨 基酸为跨膜蛋白，第243~459位氨基酸为胞内蛋白。以pET28a和pET32a原核载体诱导表达CD127胞外片段可获得大 小介于34~43 kD 的融合蛋白，经Ni亲和层析柱纯化后用于免疫Balb/c小鼠，6只免疫小鼠血清中的多克隆抗体均能对 + + 猪淋巴细胞中的CD3 阳性细胞（CD3 ）进行共标记，其中以M2和M4两只免疫小鼠抗血清对CD3 的共标记效果较优， + 分群清晰；但流式细胞仪检测发现，仅2.3% 的CD3 能与M2混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记，而67.0% 的 + CD3 能与M4混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记，且分群清晰。从M4混合池中筛选出6株效价稳定的亚克隆 + 细胞株（1E2 、1D8、2F3、2F8、3C6和4E 1），且以1D8、2F3、2F8和3C6亚克隆抗体标记的CD3 较多，其培养基上清液中的 分泌抗体在猪胸腺和肌肉样品中均能检测出大小约50 kD 的单一目的条带。【结论】制备获得的猪CD127流式单克隆 抗体可与T淋巴细胞表面的IL-7受体特异性结合，同时在流式细胞仪检测过程中可用于猪Treg细胞亚群检测。