乳腺良恶性增生性病变的克隆性分析及pik3ca突变的相关研究.docVIP

乳腺良恶性增生性病变的克隆性分析及PIK3CA突变的 相关研宄 參复旦大学 博士学位论文 乳腺良恶性增生性病变的克隆性分析及 PTK3CA突变的相关研宄 学科专业： 研究方向： 博士生： 博士导师： 导师小组成员： 病理学 肿瘤分子病理 李华 朱虹光教授 张锦生教授 陈琦主管技师 參目录 屮文摘要？ 1 英文摘耍?5 前言9日U舀？ 第一部分乳腺导管内增牛.性病变的克隆性分析 引言?？。13 材料和方法?？13 结果?？ 16 讨论??22 小结23 参考文献??. :.23 第二部分检测乳腺导管内增生性病变和浸润性癌组织的PIK3CA突变 引言.；j26 材料和方法??26 结果28 讨论??36 小结39 参考文献39 第三部分PIK3CA突变与乳腺癌临床病理学指标的相关性 引言42 材料和方法??42 结果43 讨论??48 小结51 参考文献51 综述??55 在读期间撰写的论文?66 缩略词？. 67 致谢??68 ? ? 中文摘耍 乳腺良恶性增生性病变的克隆性分析及PTK3CA突变的相关研宄 中文摘要 .1 八— 刖g 乳腺导管内增生性病变是指乳腺导管上皮细胞具有一定异形性，但仍保存原 有腺体结构或基底层，没有间质浸润的一类导管内增生性病变。根据组织细 胞形 态，分为普通导管内增生Usualductalhyperplasia, UDH、导管上皮内肿瘤 Ductal intraepithelialneoplasia, DINIA 级、IB 级、1C 级、2 级、3 级。长期以 来一直认为， 正常上皮经过增生、不典型增生、原位癌等进展为浸润性癌是一个连续过程, 但 是乳腺导管内增生性病变究竞在哪个阶段演变为肿瘤，目前还是悬而未决的 题。 肿瘤起源于单个细胞，即单克隆性增生，而以修复为目的的反应性增生则为 多克隆，所以克隆性分析是区别肿瘤性增生和反应性增生的关键。基于女性 X染 色体嵌合性失活的雄激素受体基因多态性分析是最常用和最理想的一种克 隆性 分析方法。 按照一般理论，恶性肿瘤发生发展的多步骤过程是基因损伤逐渐积累的结 果。在这个竞争性选择过程中，获得新的基因改变被认为是肿瘤进展的限速 步骤。 P13K/AKT信号通路调控细胞的生存、增生和迁移等生物学行为,和人类肿 瘤密切相关，如PTEN通过基因缺失或突变等造成的功能缺失以及AKT和 P1K3CA等基因扩增都参与肿瘤的发生。不过最令人振奋的是最近发现1A类 P13Ks的pi 10妇t的编码基因PTK3CA在结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤高 频率突 变，90%以上的突变位点集中在螺旋|X:和激酶|X:，突变的pllOa活性增加。 PIK3CA在乳腺癌组织屮的扩增率只有8. 70A，而突变率达20%以上，被认为 是除P53突变和HER2扩增之外最常见和最重要的乳腺癌基因改变。P1K3CA 基因 突变发生在乳腺癌演进过程中的哪个阶段?该基因突变后对乳腺癌的演进进 程 有何影响？关于这些问题都没有相关的文献报道。EPIIER2和淋巴结转移状 态等病理学指标与乳腺癌治疗方案的选择以及预后有关，但是关于这些病理 学指 标与PIK3CA基因突变相关性的文献报道还比较少，并且观点不一致。 基于上述研究背景，本课题运用X染色体连锁雄激素受体基因多态性分析 的方法,分析女性乳腺导管内增生性病变的克隆性以提供其肿瘤性增生的直 接证 据;检测乳腺导管内增生性病变和浸润性癌组织屮HK3CA基因突变，明确 P1K3CA突变在乳腺癌发生发展过程中发生的时间，以便于更有针对性地进 行相 參參 ■ 屮文摘要 关功能研究;阐述PIK3CA突变与乳腺癌临床病理特征的关系，为将来预后评 估 和个性化的治疗提供依据。 第一部分 乳腺导管内增生性病变的克隆性分析 目的检测各类乳腺导管内增生性病变的克隆性起源，明确哪类乳腺导管内增 生 性病变为真正的肿瘤。 方法以101例女性乳腺导管内增生性病变石蜡组织标木为研究对象。激光捕 显微切割技术分别将增生的和周围正常的导管上皮细胞精确分离，抽提其基 因组 DNAo设计X染色体人雄激素受体humanandrogenreceptor, HUMARA基因外显 子1的PCR扩增引物并标记荧光,所跨区域包含与X染色体失活有关的甲基 化位点 和呈高度多态性的CAG核苷酸短串联重复序列shorttandemrepeat, STR。甲 基化敏感的限制性切酶Ilpall消化前、后的基因组DNA为模板，PCR扩增 HUMARA外显子1，然后在DNA测序仪上毛细管电泳并分析HUMARA两个位点 的荧光强度。 结果101个病例中，有88例PCR扩增HUMARA外显子1成功。其中 20/8822. 73%的病变周围正常组织DNA在未经Hpall消化时，扩增出一条条 带， 臣PCAGn呈纯合性，