规模化猪场猪圆环病毒2型感染的PCR检测及四川病毒株的分离鉴定-预防兽医学专业论文.docxVIP

摘猪圊环病毒(Pcv)的开放阅读框2(0RF2)是其主要结构蛋白(Cap)的编码基因， 摘 猪圊环病毒(Pcv)的开放阅读框2(0RF2)是其主要结构蛋白(Cap)的编码基因， 也是区分猪圆环病毒1型(Pcvl)和猪圆环病毒2型(PCV2)的重要基因，本研究参照 GenBank己发表的15株PCv2基因序列，设计合成一对引物，对PCV2的0RF2基I习进行 PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，呈现一条大小约0．67kb的特异条带，经条件筛选， 建立了猪病料中Pcv2感染的PcR检测方法。采用建立的PCR方法对四川9个规模化猪 场104头猪的病料进行PCv2检测，结果表明，受检猪的组织及血清样品中PcV2的总检 出率为77．9％，证实四川规模化猪场存在PcV2感染。 对Pcv2感染猪的症状及病理变化进行观察，结果表明，患猪主要表现为仔猪生长 不良、腹泻及怀孕母猪流产等症状，患猪精神不振、消瘦，发生黄疸。剖检可见全身淋 巴结显著肿大，肺脏出血、水肿以及发生肉样变等病理损伤，病理组织学观察发现组织 器官内淋巴细胞减少，生发中心内淋巴细胞消失，在巨嗜细胞内发现嗜碱性包涵体。 将PCR检测为阳性的病料接种PKl5细胞，盲传6代后进行电镜观察，结果在PKl5 细胞的细胞核及细胞质中发现包涵体。细胞质中包涵体电子密度深，位于核膜周围，内 有呈晶格状排列的病毒粒子，直径12±2nⅢ；细胞核内染色质消散，在细胞核内发现多 个电子密度深的、圆形或环状、由大量异染色质组成的包涵体，内有细微的粒状物质。 分离鉴定获得PcV2四川毒株l株。将病毒在PKl5细胞上传6代后，提取病毒DNA，设计 引物扩增全序列，并进行全基因组序列的测定与分析。结果表明病毒的全基因组为 1767bp，与国内外分离毒株(15株)的全基因组序列比较发现，该分离株与我国湖南分 离株(AY556477)的同源率为97．5％，与欧洲、美洲、南非毒株的同源率在94．2-96％之间。 本研究建立了针对PCV2 ORF2基因的PCR检测方法，可对病料、血清提取DNA进行 检测，在7小时内得出结果。该方法可用于PcV2感染猪的快速诊断，可用于Pcv2感染 的流行病学调查、引种检疫等。本研究丰富了我国PCV2感染的流行病学资料，为规模 化猪场有效诊断防治猪圆环病毒病提供了科学依据。 关键词：猪圆环病毒2型PcR检测全基因组测序 。本研究获得“十五”国家重点科技攻关计划的资助(课题编号：2002BA514．112．3) l 一前言猪圆环病毒(Porcine 一前言 猪圆环病毒(Porcine circovinls，PCV)是迄今为止发现的最小的一种脊椎动物病毒。 根据Pcv致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，将PCV划分成了无致病性(或PKl5源 性)的猪圆环病毒l型(PCVl)和有致病性(PMWS源性)的猪圆环病毒2型(PCV2) 两个基因型13’511。PCVl广泛存在于猪体内及猪源代细胞系中，无致病性，不能引起 细胞病变；PCV2具有致瘸性，主要引起一种新被发现的传染病一断奶仔猪多系统衰竭 综合征(Post-weaning mulfisystemie wasting syndrome，PMWS)，PMWS是继PRRS后又 一被发现的猪的免疫抑制性疾病。 P瑚s以进行性消瘦和多系统病理损伤为主要特征，是一种免疫抑制性疾病，患病 猪主要表现为进行性消瘦，生长发育受阻，皮肤苍白或有黄疸，呼吸道症状，体表淋巴 结肿大，偶有腹泻。PCV2病毒除了能引起PMWS外，还可以造成猪皮炎与肾病综合 征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)[s61，并与怀孕母猪的繁殖障碍 (SOW abortion and mortality syndrome，SAMS)剐、新生仔猪的先天性阵颤(Congenital tremors，CT)【8l】、新生仔猪的腹泻病【331、增生性坏死性肺炎(Proliferative and neerotizing pneumonia,PNP)的发生密切相关。 1991年加拿大学者首次详细报道了在加拿大西部一个SPF猪群发生的PMWS疾 病[20l，随后，美国、大部分的欧洲国家以及亚洲的一些国家都相续报道了该病的存在‘1· 9’17,18，35，38，64，79，861。到1994年，由PCV2引起的PMWS已广泛流行于加拿大，现己在 美国、法国、英国、西班牙、意大利、德国、丹麦、新西兰、荷兰、北爱尔兰、墨西哥 等许多国家和地区蔓延。亚洲地区的日本、韩国、中国台湾省也有此病的报道。郎洪武 u1等采用ELISA方法对北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南7省f市)22个猪 群采集到的猪血清样品共559份进行PMWS抗体的检测，结果