氦氖激光对体外培养神经元的影响-神经内分泌专业论文.docxVIP

郑州大学2005硕士学位论文 郑州大学2005硕士学位论文 氪氖激光对体外培养神经元的影响 氮氖激光对体外培养神经元的影响 研究生 张颓清 导师 吴爱群 楚宪襄 郑，H大学基础医学院人体解削教研室 河南 郑州450052 摘要 背景和目的随着社会老龄化的进展及小儿大脑发育不全疾病的增多，对老年性 中枢神经系统退行性疾病和小儿大脑发育不全的研究，越来越成为当今神经科学 集中的焦点。近年来，诸多学者进行多方面研究，努力寻求促进神经元生长发育， 延缓神经元衰老死亡的有效方法。神经元是神经系统结构和功能的基本单位。研 究神经元的生长、发育及衰老必然为研究神经系统的生长、发育及衰老提供依据， 同时也为小儿大脑发育不全及中枢神经系统老年退行性疾病的发病机制和有效 的治疗提供理论依据。特别是近年来神经细胞的体外培养为神经细胞衰老、死亡 的研究提供了广阔的前景。氮氖激光为低能量激光，目前已作为一种非药物治疗 手段广泛应用于中枢神经系统某些疾病及其他系统疾病的防治。但其对中枢神经 元是否具有确切地促进生长发育、延缓衰老、抗损伤的作用?其作用机制是氮氖 激光对神经元引发的单一生物刺激效应或是归咎于神经元周围微环境因素的改 变?至今尚无定论。因此本实验采用新生大鼠海马及部分额叶皮质神经元进行体 外培养，并以低强度氮氖激光对其进行一定剂量的照射，观察其对神经元生长发 育及延缓衰老的影响。进一步探讨氮氖激光对神经元的作用及其作用机制，为小 儿大脑发育不全、中枢神经系统老年退行性疾病的治疗和康复保健提供理论依 据，寻找新的、有效的方法。 材料和方法 随机取足月新生1d内的wistar大鼠1 2只，体重6．3±0．5克。 常规消毒后迅速断头取脑，在无菌条件下分离出双侧海马及部分额叶皮质，消化 分散后，用种植培养液(高糖DMEM+10％胎牛血清)稀释以0．5-1．0×105个细胞 密度悬液，接种于预先经多聚赖胺酸处理过的4块2 4孔培养板中，每孔中均有 经多聚赖胺酸处理过的无菌盖玻片一块。置于37。c、5％C0：的细胞培养箱内培养。 郑州大学2005硕士学位论文 郑州大学2005硕士学位论文 氰氖激光对体外培养神绎元的影响 24h后弃去皿内种植培养液，换入无血清饲养培养液(B27培养液)，以后每3d 更换l／3量无血清饲养培养液一次。于种植第3天用神经特异性烯醇化酶(NSE) 抗血清按ABC法免疫组化染色进行神经细胞鉴定。并随机挑选细胞分散均匀、生 长较好的两块培养板按列分为4组：l正常对照组：单纯饲养培养液培养不加任 何光照。Ⅱ普通红光对照组：饲养培养第2d开始用普通红光进行照射，输出功 率为3mw，光斑直径为3mm，每次3min，垂直照射，距离为4-5cm，保证照射范 围略小于每皿面积。Ⅲ脑活素药物对照组：饲养培养液加入脑活素，浓度 200 u g／m1，单纯培养不加任何光照。IV激光照射组：饲养培养第2d开始采用波 长为632．8rim的氦氖激光进行照射，输出功率为3mW，光斑直径均为3mm，照射 方法同Ⅱ组。普通红光对照组和正常照射组照射时将另外2组培养神经元同时取 出，同样放置但不照射。实验开始后每天定时在倒置相差显微镜下观察神经元生 长发育情况，分别于第7d、14d、21d、28d取每组各50个视野观察并记录神经 元存活数目、胞体面积、长径、突起长度作比较，并于种植后14d生长旺盛时期 取出皿内盖玻片Nissl化学和免疫组化染色。光镜下观察，计数，灰度分析，并 于饲养培养后21d神经元开始衰老死亡时期，测定已换入3d的培养液中超氧化 物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的浓度。最后作统计学处理。 结果 1．神经元存活数目、胞体面积、直径及突起长度 神经元于种植12 h后大部分已贴壁。于第7d可见激光照射组和脑活素药物 对照组神经元长势良好，突起较长，且广泛形成稠密的突起网络，两组比较无明 显差异，正常对照组和普通红光对照组神经元数目较少，形成的网络较稀疏， 与激光照射组和脑活素药物对照组有明显的差异。特别是21d时正常对照组和普 通红光对照组神经元已开始退化死亡，而激光照射组及脑活素组长势良好，广泛 形成稠密的突起网络。神经元数目分别为I：63．5±2．6细胞个数／视野、II：64．8 ±2，3细胞个数／视野、llI：103．212．5细胞个数／视野、IV：105．1±3．5细胞个 数／视野。至28d时正常对照组和普通红光对照组的神经元已全部死亡，另外两组 尚有