细胞生物学3.细胞生物学研究方法讲述说明.ppt

Techniques in Cell Biology;光学显微镜技术（light Microscopy） 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope）;一 光学显微镜技术（light icroscopy）; 显微镜适合的放大倍数 放大倍数 ：是眼睛看到像的大小与对应标本长度大小的比值。 放大倍数＝目镜的放大倍数X物镜的放大倍数 ; ① 固定：可使生物大分子交联，蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象。 常用固定剂：甲醛、戊二醛、乙醇 ② 包埋：便于切片，防止样品移位,常用包埋剂：石蜡 ③ 切片：生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成1～10μm的薄片 ④ 染色: 苏木精－对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布 伊 红－可使细胞质染色 ;苏木精-伊红染色，又称“苏木素-伊红染色”，或“HE染色”（hematoxylin and eosin stain、HE stain），是组织学最常用的染色方法之一。 ;正置显微镜;（二）荧光显微镜 FLUORESCENCE MICROSCOPE; 荧光显微镜的种类 透射式 落射式;荧光显微镜的在生命科学中的应用：;;;（三）激光共聚焦扫描显微镜;WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY;;由于点对点扫描去除了杂散光的影响;2008年的诺贝尔化学奖授予了从事有关“绿色荧光蛋白质的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家:下村修、马丁·查尔菲和钱永健。;（四）相差显微镜;用途：观察未经染色的玻片标本;相差显微镜观察的活细胞;（五）微分干涉差显微镜; 微分干涉差显微镜的应用： ;二、 电 子 显 微 镜;各种光及电子束的波长;透射电子显微电镜;1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别 ;2、电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数; 由于电子束穿透力很弱，因此用于电镜观察的标本须制成厚度仅20－50nm 的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。;取材:要快，避免损伤，标本必须薄，小 固定:常用戊二醛和四氧化锇固定，四氧化锇除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 脱水:等级梯度脱水，用脱水有利包埋。 包埋:为制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击, 切片前需包埋,常用环氧树脂。 切片:将样品制成50～100nm厚的薄片。 染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成, 散射电子能力弱, 无明暗反差,需进行染色。 常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。;观察组织、细胞内部超微结构。 分辨率0.2nm。 ;;用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品 进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处和样品周围铺 了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染 效果，分辨力可达1.5NM左右。;亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。;①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。;②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,暴露出了断裂面的膜和其它一些结构,增强了断面的浮雕效果－蚀刻。;③标本蚀刻后，再向断裂上以45°喷金, 90°喷碳后将样品浸泡于腐蚀液中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂－碳复型膜。 ④复膜显示出了标本蚀刻面的形态，捞于载网上干燥后可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 ; 细胞冰冻断裂后的电镜图像;（二）扫描电子显微镜;扫描电子显微镜原理;扫描电子显微镜生物样品制备的基本操作程序;扫描电镜照片展示;扫描电镜照片展示;扫描电镜照片展示;;（三）扫描隧道显微镜SCANNING TUNNELING MICROSCOPE， ;; 1、原子级高分辨率。如STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm，即可以分辨出单个原子，具有原子级的分辨率。 ??2、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵和一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列,而不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤——纳米科学水平。;第二节 细胞组分的分析方法;一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其合物 各种离心技术——离心是研究亚细胞成分和生物大分子的基本手段。 1924年 svdberg发明了世