肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓差异表达基因及可变剪接研究-神经病学专业论文.docx

愀蚪8㈣9㈣2帅 愀蚪8㈣9㈣2帅Y1 801 目 录 中文摘要 l 英文摘要 O O 5 英文缩写 11 研究论文肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓差异表达基因及可变剪 接研究 弓I言 13 第一部分肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓差异表达基因研究 前言日IJ舌 · “ ···一 ·· ” ····”“ ·····一”““lb15 材料与方法 16 结果 ····· ···· ··· · ··33 附图 37 附表 42 讨论 ······ 48 ／J、结 51 参考文献 52 第二部分肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓可变剪接研究 前言日lJ吾 ·····”“” b’，·57 材料与方法 57 结果 · ········· · ·59 附l訇 ······ 61 附表 ······一· 63 讨论 · · ··········· ·· 66 ／J、结 69 参考文献 69 第三部分肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓差异表达基因及可变剪 接的验证研究 前言日lJ舌 “·““ 一 ‘，73一 材料与方法 74 结果 · 一79 · · · ··80 · ”·· ··83 ·．．·” ·”· · ··· ··86 · ”· 86 ·” ·· 一92 ·一 ·· ” “ ·93 ·······································-···············109 ··· ··一· ··110 中文摘要肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓 中文摘要 肌萎缩侧索硬化转基因鼠模型腰髓 差异表达基因及可变剪接研究 摘 要 肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是～种最常见 的成人发病的神经退变性疾病，其特征是脊髓、脑干及运动皮质上、下运 动神经元进行性及相对选择性的退变。病人表现为进行性的瘫痪与肌肉萎 缩，约半数在发病3～5年内死亡，死因多为呼吸衰竭。每年全球发病率约 为(1---2)／100 000，其终生发病率约为1／600至1／2 000。 90％的ALS病例为散发性，其余10％为家族性，二者的临床表现及病 理特点难以区分。20％的家族性病例与细胞质中铜／锌超氧化物歧化酶 (SODl)发生的某种基因突变相关联。这种SODl基因突变属于发挥主导 作用的错义突变，致使一种氨基酸被另一种氨基酸所替代，例如甘氨酸被 丙氨酸所替代(SODl一G93A)。因为表达入SODl突变的动物亦在成年期 发病，且临床表现及病理特点与人类患者非常相似，故这种转基因动物已 成为广泛采用的ALS动物模型。实际上，绝大多数的突变SODl并未影响 酶学活性，其引发的病理效应可能源于生物学功能方面的毒性获得。尽管 在对ALS深入研究的基础上，学者们提出了解释SODl突变效应的几种假 说，包括氧化应激、谷氨酸毒性、大分子聚集体形成、线粒体功能失调及 凋亡等假说，但是，目前人们对SODl突变促发ALS的确切机制依然所知 甚少。 高效的基因组学技术为阐释复杂的疾病发病机制及其调控提供了宝 贵的机遇。mRNA转录本的可变剪接是转录后调控的重要形式，它将 mRNA前体中的内含子选择性移除，同时将外显子组合连接成多种形式 的成熟RNA。数量有限的基因可扩展表达为非常复杂的蛋白质组，因此 可变剪接在产生蛋白质组学的多态性方面发挥着重要的作用。据估算，在 所有的人类基因中发生可变剪接者约占3／4。目前资料显示，90％以上的 人类基因发生了可变剪接。ASTD数据库(http：／／www．ebi．ac．uk)资料显 示57％的小鼠基因发生可变剪接。研究者越来越认识到mRNA剪接在许 多重要的生理过程如发育、生理和疾病中，发挥着主导作用。Affymetrix外 中文摘要显子芯片迅速获得业界认可并成为同时检测基因水平和外显子水平表达 中文摘要 显子芯片迅速获得业界认可并成为同时检测基因水平和外显子水平表达 的操作标准。 新近的研究表明可变剪接在神经系统尤其普遍。已有报道ALS中TAR DNA．结合蛋白43(TDP．43)的异常剪接可增加聚集和细胞毒性作用。啮 齿类动物中的谷氨酸转运体l(在人类称为EAAT2)以一种复杂的模式发 生可变剪接，包括5 7端与3’非翻译区及几个编码区异构体。尽管可变剪接 在神经系统普遍存在，但在ALS中的研究甚少。 本研究应用Affymetrixd,鼠外显子1．0 ST芯片来检测SODl．G93A转 基因小鼠及其同窝同性别非转基因对照动物腰髓基因的差异表达与外显 子的可变剪接，并通过RT-PCR方法对上述检测结果进行验证。每张芯片 大约包含5．4兆个探针(1．4兆个探针组)，覆盖了约1百万个已知的和预测 的外显子。大约90％的外显子被4个探针所覆盖，这些针对同一个外显子 设计的探针组