回味茵陈四逆汤对胆道闭锁肝纤维化的临床疗效及TGF-β1Smads通路研究-中医儿科学专业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 (HSC—T6)活化增值的影响2．1含药血清的制备60只SD大鼠按随机数字表法分为3组：空白组，中药高 (HSC—T6)活化增值的影响 2．1含药血清的制备60只SD大鼠按随机数字表法分为3组：空白组，中药高 剂量组，阳性药物组，药物给药剂量参照文献“药理试验中动物间和动物与人体间的 等效剂量换算”，其中中药给予正常剂量的2倍制备高剂量含药血清，使用时采用空 白血清稀释；空白组给予与中药相同体积的蒸馏水灌胃，阳性药物组给予正常剂量； 连续3天，每天给予2次灌服，第4天晨给予1次剂量灌服，2h内腹主动脉取血，4℃， 3000 r／min，离心30 min，将同组大鼠离心所得血清混合，56℃水浴灭活30 min， 最后用0．22 um的针头滤器过滤除菌，分装后-20℃保存备用。临用前用空白大鼠血 清将中药血清稀释为中、低剂量使用； 2．2细胞分组空白组(含10％正常大鼠血清一DMEM培养液5 m1)、模型组(含 10％正常大鼠血清-DMEM培养液5 m1)、阳性药物组(含10％正常大鼠阳性药血清 -DMEM培养液5 m1)加味茵陈四逆汤大鼠血清高剂量组(含10％大鼠高剂量血清 一DMEM培养液5 m1)、中剂量组(含10％大鼠中剂量血清-DMEM培养液5 m1)、低剂 量组(含10％大鼠低剂量血清-DMEM培养液5 m1)、除正常组外，其余各组分别加入 TGF—B 1(终浓度10 g／L)，将各组细胞置于5％C02培养箱培养； 2．3 CCK8法检测吸光度将细胞数按5000个／ml接种至96孔板，每孔lOOul，均 设5个复孔；分别于培养箱中培养48、72小时后每孔加入lOul CCK8，继续培养半小 时后酶标仪检测450nm处测定吸光度A值，结果以5个复孔A的均值表示。 3．RT—PCR检测含药血清对TGF—B 1干预的大鼠肝星状细胞株(HSC—T6)Z B R1、 Smad3、Smad7、collagen I、collagenHImRNA的表达 3．1含药血清的制备同2．1及细胞的分组同2．2； 3．2将空白组、模型组、阳性药物组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂 量组细胞置于5％C02培养箱培养48 h(细胞数lxl05／m1)。培养结束后用PBS清 洗3遍，弃去PBS，用处理过的细胞刮刀刮取细胞，并转移至1．5 ml EP管中，4000 r／min 4C 3 min离心弃上清。采用RT—PCR检测T B R1、Smad3、Smad7、collagen I、 collagenIIImRNA的表达，以B—action为内参照， 2‘△郜‘计算各基因表达进行分析。 4．Western blot检测加味茵陈四逆汤含药血清对TGF-B 1干预的大鼠肝形状细 胞株(HSC—T6)T B R1、Smad3、Smad7、collagen I、c01lagenIII蛋白的表达 4．1含药血清的制备同2．1及细胞的分组同2．2； 4．2将空白组、模型组、阳性药物组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂 量组细胞置于5％C02培养箱培养48 h(细胞数lxl05／m1)。培养结束后用PBS清洗 3遍，弃去PBS，用处理过的细胞刮刀刮取细胞，并转移至1．5 ml EP管中，4000 r／min 4℃3 min离心弃上清。采用Western blot检测T B R1、Smad3、Smad7、collagen I、 collagenlII蛋白的表达，以B—action为内参照，以相应蛋白灰度结果与B—action 的比值作为相对表达量进行统计分析。 结果：1．加味茵陈四逆汤可以有效改善患儿的黄疸程度、精神状态、腹胀程度、呕吐症 结果： 1．加味茵陈四逆汤可以有效改善患儿的黄疸程度、精神状态、腹胀程度、呕吐症 状、食量、大便的颜色性状以及患儿肝脾肿大体征，在一定程度改善了忠儿生活质量， 且本研究也显示加味茵陈四逆汤可有效改善患儿的肝功能及肝纤维化六项等实验室 指标。 2．给予外源性刺激因子TGF-13 1(10ng／m1)刺激，在48小时后中药各剂量组 含药血清与空白血清相比均可抑制细胞的增殖(PO．05)，72h时后中药各剂量含药 血清对细胞的增值与空白血清相比无明显影响(PO．05)； 3．@TGF—t3 1诱导的HSC-T6细胞模型组Y 13 R1 mRNA表达与空白组相比无显著差 异(胗0．05)，阳性药物组和加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组与模型组相比无显著 差异(F0．05)：②TGF一13 1诱导的HSC细胞模型组smad3 mRNA表达与空白组相比 有显著差异(PO．05)，加味茵陈四逆汤中剂量组与模型组相比有显著差异(PO．05)： ③TGF—B 1诱导的HSC细胞模型组smad7 mR