鸡空肠弯曲杆菌感染相关microRNA的鉴定及其调控机制的研究-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

2．2．2．1 2．2．2．1 3’端接头连接，5’端接头连接 16 2。2．2．2反转录以及扩增反应 ．16 2．2．2．3 cDNA纯化 17 2．2．3文库质检 1 8 2．2．4 Cluster生成及上机测序 1 8 2．2．5 Illumina／Solexa测序数据的分析 一1 8 2．3 差异表达miRNAs的qRT-PCR验证 20 2．3．1盲肠组织总RNA的提取及质量检测 ．20 2．3．2 miRNA反转录 ．21 2．3．3 qRT-PCR ．21 2．4差异表达miRNAs靶基因(与免疫相关)表达分析 23 2．5差异表达miRNAs不同时间点表达 26 2．6差异表达miRNA的靶基因不同时间点表达 26 2．7数据统计与分析 26 3结果与分析 。27 3．1 RNA质量检测 一27 3．2文库构建及文库质检 28 3．3测序数据质量及序列长度分布统计 29 3．4 Small RNA分类注释 32 3．5饱和度分析 33 3．6 miRNA的差异表达分析 ．．33 3．7差异表达miRNA靶基因预测 35 3．8差异表达miRNA靶基因的GO注释 35 3．9差异表达miRNA靶基因的KEGG分析 35 3．1 0差异表达miRNA的qRT-PCR验证 ．36 3．11差异表达miRNAs不同时间点表达 ．．38 3．12差异表达miRNAs靶基因(与免疫相关)不同时间点表达 一40 4讨论 ．．42 4．1 Solexa测序数据质量的可靠性 42 4．2 miRNA与其靶基因之问关系的研究及对空肠弯曲杆菌感染的调控 一43 万方数据 5结论与展望 5结论与展望 ．．． 48 5．1结论 ．48 5．2创新与展望 48 5．2．1创新之处 48 5．2．2研究展望 48 参考文献 49 致谢 65 攻读学位期间发表论文情况 。66 万方数据 山东农业人学硕二l二学位论文中文摘要 山东农业人学硕二l二学位论文 中文摘要 空肠弯曲杆菌，一种食源性病原茵，给人类带来了严重的经济损失和食品安全问题， 盲肠是其主要定殖部位。宿主的遗传背景在鸡抵御空肠弯曲杆菌中起重要作用，不同品 系(品种)的鸡对空肠弯曲杆菌的易感性／抗性有显著差异。 mieroRNA(miRNA)是一类长度约22m的内源性非编码小RNA，与靶基因3’UTR结 合抑制靶基因的翻译或对靶基因进行切割，在细胞增殖、分化、凋亡、神经发育、脂肪 代谢等很多生物学过程中发挥重要作用。最近研究显示，miRNA在细菌、病毒感染中 也发挥重要作用。 近几年，Solexa高通量测序技术成为各物种microRNA分析鉴定的有力工具，在鸡 上也有部分报道，并且也有与细菌、病毒感染相关的microRNA报道，但与空肠弯曲杆 菌感染相关的microRNA表达水平的变化尚未见报道。 根据空肠弯曲杆菌感染后的动态变化及阳性率结果，本研究以感染与非感染空肠弯 曲杆菌8h SPF鸡盲肠组织为研究对象，构建感染(T)与非感染(C)状态下盲肠组织 的小RNA文库，T1、T2、C1、C2。利用Solexa高通量测序技术分析鉴定感染与非感 染鸡盲肠组织中差异表达的miRNA，并对所得高通量测序结果利用荧光定量PCR进行 分析验证，同时，利用荧光定量PCR研究部分表达差异的miRNA及其免疫相关靶基因 不同时间点的表达情况。结果显示： (1)通过Solexa高通量测序，在T1、T2、C1、C2四个文库中分别获20724738质量读数，分别占到其总读数的92．08％、89．08％、 94．94％和97．85％：分别获得被注释的reads1666330616465067。 占高质量读数的93．O％、94．8％、96．3％、93．4％；分别获得小RNA序列的数目为423943、 370108、297619、449905；分别获得被注释的d,mqA序列数为106919、83918、67690、 106739。占小RNA序列数的25．2％、22．7％、22．7％、23．7％。 (2)小RNA长度分布统计结果表明：四个文库中小RNA序列主要分布在20．24nt之 间，22nt序列最多，在四个文库中分别占到47．98％、50．64％、51．5％和48．6％，其次为21 nt和23 nt。不同片段长度的小RNA在四个文库中呈现差异分布。 万方数据 鸡空肠弯曲杆菌感染相关microRNA的鉴定及其调控机制的研究(3)四个文库中共发现已失llmicroRNAs 鸡空肠弯曲杆菌感染相关microRNA的鉴定及其调控机制的研究 (3)四个文库中共发现已失llmicroRNAs 450个