第四章-DNA序列测定.pptVIP

测序产物纯化与变性 * 上样电泳（测序仪） 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。 * 分析结果 仪器将自动进行序列分析 * DNA测序自动化的特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h * DNA自动测序与手工测序的不同点 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动 测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物； 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应 物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内 电泳； 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡 聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序 则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑。 * 第四章 DNA序列测定 * DNA序列测定即DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 * DNA序列测定常用方法有如下3种 1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA自动测序 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，PAGE后，通过放射自显影可直接读出DNA顺序。 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 特点 简便、迅速、应用广泛。 不需酶促反应， 1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、简单迅速8-10h。 * 一、Sanger双脱氧末端终止法 * 测序原理 1.反应： 在 DNA 聚合酶的催化下，按碱基互补配对原则逐步在引物的 3 ‘端加上四种脱氧核糖核苷酸，四个反应管中的 ddNTP 随机地与 dNTP 竞争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，反应产物可以在电泳图谱上形成一系列相差一个核苷酸的单链 DNA 梯带。 2.电泳： 对反应产物进行变性聚丙烯酰胺电泳， 3.读序： 经放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。 * 链终止剂——2’，3’双脱氧核苷酸（ddNTP） 特点： 由于ddNTP没有3’-OH，下一个核苷酸不能通过5’磷酸形成3’，5’磷酸二酯键，使酶催化的链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。 * * O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH 脱氧核苷酸的连接 * O 碱基 C P O H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 H2O 脱氧核苷酸的连接 * O 碱基 C P H H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH X 双脱氧核苷酸… ? * 测序反应液的组成： 待测DNA片段、DNA聚合酶、MgCl2、引物、4种dNTP、水 反应体系： 在4个反应管中分别加入4种ddNTP中的一种，形成4个反应体系，即：ddATP体系、ddTTP体系、ddGTP体系、ddCTP体系 标记物：放射性同位素 标记载体：dNTP、ddNTP、引物 * * 二、Maxam-Gilbert化学裂解测序法 * 化学裂解法（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。 化学法原理是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 * 化学法裂解DNA链的原理 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断裂磷酸二酯键。 使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂解和鉴别方法如下： * 表一、特异断裂4种脱氧核苷酸的方法 作用的碱基 试剂与反应 碱基释放 DNA断裂 强G/弱A 稀释250倍硫酸二甲酯，在50 mM卡可酸（pH 8.0）10 M MgCl2、0.1 M EDTA 20℃ 60分钟，DNA G的N7和A的