几种草坪草的组织培养与转基因研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

几种草坪草的组织培养与转基因研究中文摘要 几种草坪草的组织培养与转基因研究 中文摘要 草坪草在人类生活中的地位越来越重要，筛选与培育优良的草坪革新品种是草坪业的 重要任务。本文对假俭草[Eremoch]oa ophZuroides(#unro．)Hack，1，高羊茅(Festuca arundinacea Schreb．)，狗牙根(CynodondactylonvaL)，多年生黑麦草(LoliumperenneL) 四类草坪草进行了组织培养与植株再生的研究，建立了假俭草与高羊茅的遗传转化体系并 对其进行了转基因研究，获得了抗除草剂与抗真菌病的假俭草与高羊茅转化植株。 草坪草组织培养体系的建立与完善将为传统与转基因育种奠定基础，本研究在这方面 取得了以下结果： 1)在外植体的选取方面，发现高羊茅离体成熟种胚比完整种子作外植体愈伤组织的诱 导率与质量都优，假俭草以含低浓度2，4一D的培养基上萌发的芽尖作外植体最佳。 2)高苇茅、假俭草、黑麦草诱导愈伤所需最佳2，4一D浓度不同，假俭荦达到最高诱 导率67．5％的2，4一D为3．5 mg／U，黑麦草达到最高诱导率85．6％的2，4一D为 6．5 mg／L。高羊茅的三个品种也具有不同的最佳2，4一D浓度，SAFari为2．5 mg／L， Barleduc为4．0 mg／L，Firewar II为4．5 mg／L。IAA对高羊茅三个品种的愈伤组 织诱导率的影响趋势与2，4一D类似，但效应不及2，4一D显著。另外，0．5 mg／L 6一BA在一定程度降低了高羊茅愈伤组织的诱导率。 3)ABA对狗牙根和高羊茅在诱导愈伤时的种胚萌芽有一定的抑制作用，同时也降低了 愈伤组织诱导率，但4．0 mg／LABA与O．5 mg／L ABA分别对高羊茅、狗牙根愈伤组 织的外观质量有显著的提高。高苹茅、假俭草和狗牙根不同外观状态的愈伤组织内 源的G如、ZT、IAA、ABA、IBA含量与比例不同，种问存在差异，种内也存在差异。 4)渗透调节剂甘露醇、蔗糖与PEG6000能提高培养基的渗透压，影响愈伤的出愈率与 质量。1％甘露醇，1％PEG6000，3％蔗糖能改普愈伤的质量，提高胚胎发生的频率， 大于5％的PEG6000则因其浓度过高，导致细胞缺水，降低了愈伤的诱导并致其褐 化死亡。 5)高羊茅、假俭草在不同的基本培养基上愈伤组织诱导率有差异，但都以‰最高，分 别达90％与30．7％，高羊茅以MS最低，假俭草则以从最低，分别为65％和20％。另 外，固化剂种类与浓度对高羊茅、假俭草愈伤组织诱导率与质量具有不同的影响。 6)不同状态的愈伤组织体细胞形状不同，胚胎发生过程也有差异，高羊茅的胚性愈伤 组织切片能观察到二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚、梨形胚、胚芽等过程，细胞 质浓核大，假俭草也类似，狗牙根的愈伤细胞则形状大，内有大液泡，观察不到胞 核，为典型的非胚性细胞。 7)不同外观状态的假俭草与高羊茅愈伤分化长芽与长根的情况不同。黄色致密结节状 的分化率高，浅白疏松水渍状的分化率低。一定量的CoCI：和AgNO。能提高假俭草 愈伤分化长芽率。 草坪的建植与养护过程中存在许多问题，杂草防除与病害防治是最重要的两个方 草坪的建植与养护过程中存在许多问题，杂草防除与病害防治是最重要的两个方 面。通过转基因手段培育抗除草剂与抗病的新品种是一种较理想的方法。本实验在转 基因研究中，基因枪转pBar--Gus于高羊茅时，以轰击2枪，子弹距可裂圆片6cm， 子弹距轰击受体6cm为最佳轰击参数。农杆菌LBA4404／pCG--II与高羊茅愈伤组织共 培养转化，固体培养基表面垫上一层滤纸，愈伤组织周围滴加浸染菌液共培养一周， 后经甘露醇及抗生素液洗涤，提高了农杆菌的转化率。建立了基因枪与农杆菌转化pCG —II与pBar--Gus的两类草坪草的优化转化系统，分别获得了转pBar—Gus的高羊茅、 假俭草及转pCG—II的高羊茅、假俭革。随机抽取的转pCG～II的高羊茅植株的Glu的 PCR检测，阳性率为80％。随机抽取的转pcG—II的假俭草植株的Chi的PCR检测，阳 性率为100％。随机抽取的转pBar--Gus的高羊茅、假俭草植株的Bar的PCR检测，阳 性率都为100％。随机抽取的转0CG一Ⅱ的高革茅植株总DNA的Glu的点杂交分析，阳 性率为90％。随机抽取的转pCG～Ⅱ的假俭草植株总DNA的Glu的点杂交分析，阳性率 为100％。随机抽取的高羊茅、假俭草转化pBar--Gus获得的植株的总DNA杂交分析， 阳性率都为100％。转pBar--Gus植株的除草剂涂抹实验和转pcG～II的禾谷镰刀菌 (，gram]nearumSchwabe)挑战接种实验，结果表明转化植株比对照都表现出了更强 的抗性。 关键