利用油体蛋白体外重组技术实现牛肠激酶固定化应用.docVIP

利用油体蛋白体外重组技术实现牛肠激酶 定化应用 摘要：为研宄利用油体蛋白体外重组技术实现肠激酶固 定化应用的可行性，利用油体蛋白o 1 e o s i n、自剪切 蛋白I n t e i n和人工合成的牛肠激酶轻链c DNA，分 别构建表达盒Int e i n — o 1 e o s i n — EK和I n t e i n — E K，插入毕赤酵母表达载体p P I C 9 K， 转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达后通过SDS_P AGE和We s t e r n — b 1 o t检测发现，带有Int e i n—肠激酶表达盒的阳性菌株中有目的蛋白的表达，而 Oleosin— intei n—肠激酶融合蛋白表达盒 不能在酵母中表达。 关键词.?油体蛋白；人工油体；肠激酶；固定化酶 中图分类号：Q 5 5 6 +. 9; Q 8 1 4 . 2文献标 识码：A 文章编号：0439— 8 11404 —0849-05 Immobilized Application of Bovine Erokinae by in Vitro Oleosin Recombination Technology DONG Li-qiangl, 2，LI M e i 2 , ZHANG Yan — yanl, 2，SUN Wen— 1 i 2，CHEN Hong-m a n 1 , LIU Yu — hui 2 Abstract: To study the p o ssibility of immobilized a p plication of enterokinae b y artificial oil bodies, two expression cassettes, oleos in— intein — EK and intein — EK， consisting of oleosin gene, intein and artificially syn thesized EK cDNA were const rue t e d . The expression cass e t t e s were then inserted in to p P I C 9 K and transformed i n t o Pichia pastoris GS115 s train. After induced by m e t h a n o 1 , SDS — PAGE and Western b lot were used to test the ex press ion products； and anal ysis showed that target pro teinwas expressed in the s t rains containing i n t e i n — E K expression cassette, while oleosin— intein — EK was not e xpressed. Key words： oleosin； a r t i f icial oil bodies； enterokin a s e ； i mm obilized enzyme 肠激酶［1］是存在哺乳动物十二指肠内的一种异源 二聚体丝氨酸蛋白酶，由两个亚基组成，分重链和轻链［2 ］， 其中，轻链是全酶的催化中心，具有全酶的催化活性，能够 识别并酶解专一性的氨基酸序列。肠激酶的轻链结构在人、 牛和猪中保守，识别序列在脊椎动物中也有很强的保守性。 又因其反应条件相对温和，非特异性切割率低，经EK裂解 融合蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N— 末端氨基酸序列，因此在基因工程制药领域成为融合表达时 下游纯化的首选工具酶之一 ［3 ］。 I n t e i n是具有自我剪接功能的多肽，能将自身 从前体蛋白中切除并催化其两侧的肽链形成肽键［4］。大 部分I n t e i n均具有蛋白质剪切活性和自导引核酸内 切酶活性。结构I由I n t e i n的N末端和C末端，几乎 均为P折叠，为剪切结构域；结构II位于I n t e i n内部， 为自导引核酸内切酶结构域。自导引核酸内切酶活性是位点 特异性的，在识别序列和功能上与核酸内含子的自导引核酸 内切酶类似，可以在无I n t e i n的等位基因的双链DN A处定点切割，引起I n t e i n的插入［5］，结构II缺 失可产生仅具有蛋白质剪切功能的I n t e i n。NEB公 司根据以上的原理研发了 I MP ACT — CN蛋白表达和 纯化系统，该系统以几丁质结合域［6］代替了 I n t e i n的结构II,表达产生的I n t e i n CBD融合蛋白可 与几丁质